TUGAS PEMISAHAN INSTRUMENTASI

Extraction and Purification of Curcuminoids from Crude

Curcumin by a Combination of Crystallization and
Chromatography
(Dosen Pengampu: Dr. Ni Putu Diantariani,S.Si, M.Si)

OLEH

I Nyoman Angga Kusuma

2182011003

PROGRAM STUDI MAGISTER KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA

2021
I. Pendahuluan

Kunyit (Curcuma longa L) adalah rempah-rempah India berwarna kuning yang diperoleh
dari keluarga Zingiberaceae. Rimpang Kunyit memiliki berbagai faktor promosi kesehatan yang
telah digunakan selama berabad-abad dalam pengobatan oriental tradisional di India dan Asia
Tenggara. Ekstrak yang diperoleh dari Kunyit terdiri dari campuran Curcumin (CUR),
Demethoxycurcumin (DMC) dan Bisdemethoxycurcumin (BDMC), semuanya dikenal sebagai
curcuminoids (Tabel.1). Di antara mereka, CUR, juga dikenal sebagai diferuloylmethane, adalah
komponen yang paling penting karena telah terbukti memiliki spektrum aktivitas biologis yang
luas seperti anti-inflamasi, efek anti-bakteri dan antikarsinogenik. Meskipun CUR memiliki efek
kesehatan yang baik, CUR belum disetujui sebagai agen terapeutik, karena stabilitasnya yang
buruk dan kelarutannya yang rendah dalam air, dan sifat bioavailabilitas yang buruk. Selain itu,
itu adalah senyawa yang tidak stabil ketika terkena cahaya atau mengalami kondisi oksidatif, yang
menyebabkan degradasi CUR menjadi vanillin, asam vanilat dan asam ferulat. Dengan demikian,
baru-baru ini baik akademisi maupun industri lebih memfokuskan minat mereka pada senyawa
DMC dan BDMC. Sampai sekarang, sedikit pekerjaan yang telah dilakukan pada sifat fisiko-kimia
dari kedua senyawa ini karena tidak tersedianya mereka dalam jumlah yang cukup sebagai
komponen murni (setidaknya dalam skala gram). CUR mentah yang tersedia secara komersial
mengandung sejumlah besar dua kurkuminoid lainnya, biasanya 17% DMC dan 3% BDMC.
Pemurnian cukup menantang, karena ketiga kurkuminoid secara kimiawi sangat mirip, dengan
satu-satunya perbedaan adalah ada atau tidak adanya gugus fungsi metoksi pada masing-masing
cincin aromatik. Pada skala laboratorium cukup sering metode kromatografi digunakan untuk
mengisolasi kurkuminoid, misalnya menggunakan silika sebagai fase diam, dan campuran pelarut
organik yang berbeda sebagai fase gerak. Sejauh ini, hasil terbaik telah diperoleh dengan campuran
kloroform: metanol, dalam skala miligram dengan kemurnian maksimum. Dalam penelitian
sebelumnya, CUR berhasil dimurnikan dengan kemurnian 99% dari campuran kurkuminoid
mentah dengan menerapkan kristalisasi pendingin dalam beberapa langkah. Dengan menggunakan
metode ini, CUR yang sangat murni dipisahkan tetapi dua kurkuminoid lainnya (DMC dan
BDMC) dibiarkan dalam larutan induk. Namun, karena laporan literatur terbaru menunjukkan
bahwa DMC dan BDMC memiliki sifat biologis yang serupa atau bahkan lebih baik daripada CUR
.14 , ada juga permintaan untuk isolasi fraksi DMC dan BDMC murni.
 Dalam literatur, fokus utama adalah pada teknik pemisahan yang digunakan untuk
mengekstrak, memurnikan dan untuk mengidentifikasi tiga kurkuminoid, lebih fokus pada
pemurnian CUR murni daripada pemurnian DMC dan BDMC murni. Fokus utama adalah
mengembangkan proses yang dapat digunakan secara komersial, yaitu untuk pengembangan
proses atau uji klinis, untuk mendapatkan ketiga kurkuminoid dalam bentuk murni dengan hasil
tinggi, mengadopsi kombinasi kristalisasi dan kromatografi cair. Dalam kristalisasi pendinginan
bertingkat CUR diekstraksi dalam bentuk murni (>99,1%) dengan rendemen 50%. Dalam
kromatografi kolom berikut yang dilaporkan dalam makalah ini, cairan induk yang tersisa diolah
untuk menghasilkan fraksi murni DMC dan BDMC, dan untuk meningkatkan hasil CUR
keseluruhan. Cairan induk yang tersisa dari langkah kristalisasi diperkaya dalam konsentrasi DMC
dan BDMC relatif terhadap konsentrasi CUR, yang memfasilitasi pemulihannya. Sesuai dengan
hasil yang menguntungkan yang disajikan sebelumnya, pada pemurnian kurkuminoid dengan
kromatografi kolom, kami menggunakan campuran kloroform dan metanol sebagai fase gerak.
Penelitian ini mencakup karakterisasi rinci dari fraksi cair yang berbeda dan fase padat
kurkuminoid yang dimurnikan menggunakan Spektrometri Massa, HPLC, dan sinar-X.

II. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan daya adsorbsi dari
suatu adsorben, baik terhadap hasil isolasi maupun terhadap pengotornya. Prinsip kromatografi
kolom adalah perbedaan daya serap masingmasing komponen. Metoda kromatografi kolom
diperkenalkan oleh Michael Tswett seorang ahli botani dari Rusia. Pada kromatografi kolom
terlebih dahulu dilakukan kromatografi lapis tipis untuk menentukan adsorben yang cocok dan
pelarut yang sesuai agar memberikan hasil yang baik. Adsorben yang paling umum digunakan
adalah silika gel, alumina, dan sephadex.
 Ada dua metoda penggunaan fasa gerak pada kromatografi kolom. Pertama metoda SGP
(Step Gradien Polarity) di mana fasa gerak yang digunakan dimulai dari pelarut non polar
kemudian kepolaran pelarut ditingkatkan secara bertahap, baik dengan pelarut tunggal atau
kombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai dengan
tingkat kepolaran yang dibutuhkan. Sedangkan yang kedua adalah metoda isokratik, di mana fasa
gerak yang digunakan tetap, baik berupa pelarut tunggal maupun campuran pelarut yang berbeda
kepolarannya dengan kombinasi yang sesuai. Metoda isokratik digunakan apabila komponen
komponen kimia dalam suatu fraksi dapat memisah dengan baik yang diketahui dari pola noda
pada kromatografi lapis tipis (Lubis, 2011).Pemisahan komponen secara kromatografi kolom
dilakukan dalam suatu kolom yang diisi dengan fase stasioner dan cairan (pereaksi) sebagai fase
mobil untuk mengetahui banyaknya komponen contoh yang keluar melalui kolom. Pengisian
kolom dilakukan dengan memasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry), dan partikelnya
dibiarkan mengendap. Pemisahan komponen secara kromatografi kolom bertujuan untuk
mengetahui komponen-komponen senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa
aktifnya (Hayani, 2007).

III. HPLC

Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun
prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam
kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia
( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi
oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang
tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya
dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang
terhubung online dengan alat HPLC tersebut.Dalam jurnal kali ini, menggunakan detector
spektrofotometer UV dimana dihasilkan Panjang gelombang spesifik dari senyawa kurkumin yang
dianalisis.

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala
polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan
eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.
A. Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi
pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas.
B. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-
senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu
retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
➢ Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut).
➢ Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel).
➢ Komposisi yang tepat dari pelarut.
➢ Temperatur pada kolom
a. Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-
senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui
berkas pada waktu itu
b. Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda
mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi
senyawa yang diperoleh

.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini
dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar.

IV. Hasil dan Pembahasan

Pada jurnal ini, metode kromatografi kolom yang digunakan adalah metoda SGP (Step
Gradien Polarity) di mana fasa gerak yang digunakan dimulai dari pelarut non polar kemudian
kepolaran pelarut ditingkatkan secara bertahap dengan kombinasi dua pelarut yang berbeda
kepolarannya yaitu kloroform dan metanol dengan perbandingan tertentu sesuai dengan tingkat
kepolaran yang dibutuhkan.

Selain berbagai percobaan pendahuluan, tiga percobaan kromatografi kolom dilakukan

secara total pada dua skala yang berbeda, satu pada skala yang lebih kecil (diameter kolom: 20
mm) dan dua pada skala yang lebih besar (diameter kolom: 73 mm). Adsorben yang digunakan
sebagai fase diam adalah silika gel (70-150 mesh). Campuran pelarut kloroform dan metanol
digunakan sebagai fase gerak. Pelarut lain seperti 1,2-dikloroetana diuji sebagai fase gerak dalam
percobaan awal tetapi tidak memberikan pemisahan yang baik dari kurkuminoid. Metanol :
kloroform (w/%) rasio yang digunakan selalu kurang dari 10 persen karena diketahui bahwa silika
dapat larut dalam lebih dari 10 persen metanol. Sampel dan campuran kloroform dicampur dengan
silika gel (11 g campuran kurkumin padat dicampur dengan 15 g silika gel) dan bubur silika ini
ditempatkan di atas silika gel. Sepotong kapas direndam dengan pelarut kloroform dan diletakkan
di atas bubur untuk mencegah terganggunya lapisan bubur. Menggunakan laju alir fase gerak
konstan 15 ml/menit, mode elusi non isokrat digunakan dengan bertahap meningkatkan
konsentrasi metanol dalam fase gerak kloroform-metanol seperti yang diberikan pada Tabel 3.

Setiap kurkuminoid diperoleh dalam bentuk murni dalam urutan CUR, DMC, BDMC
dengan meningkatkan polaritas fase gerak. Menggunakan laju alir fase gerak konstan 15 ml/menit,
profil elusi nonisokratik digunakan dengan secara bertahap meningkatkan konsentrasi metanol
dalam fase gerak kloroform-metanol.

Mulai dari pelarut kloroform murni, CUR murni dielusi dari kolom. Kemudian
meningkatkan kandungan metanol menjadi 0,4%, awalnya mengelusi campuran CUR yang tersisa
bersama dengan DMC, setelah itu fraksi DMC murni diperoleh kembali. Pada langkah ketiga
konsentrasi metanol ditingkatkan menjadi 0,7%, yang awalnya memberikan campuran DMC yang
tersisa bersama-sama dengan BDMC, dan kemudian diperoleh sebagian kecil dari BDMC murni.
Sejarah keseluruhan pelarut yang digunakan untuk setiap pemisahan kurkuminoid, massa yang
dikumpulkan dari kolom dan kemurnian masing-masing fraksi tercantum pada Tabel 3. Massa
keseluruhan fraksi CUR, DMC dan BDMC murni yang diperoleh dari 11,0 g CUR mentah adalah
8,7 g , yaitu 79% hasil keseluruhan. Terdapat 6,7% kehilangan kurkuminoid yang tertahan pada
kolom dan 13,6% kehilangan dalam fraksi dimana pemisahan kurkuminoid tidak mencukupi. Hasil
dari masing-masing kurkuminoid yang diisolasi dalam kromatografi kolom adalah 81% CUR,
79,7% DMC dan 68,8% BDMC. Selama proses gabungan menggunakan kristalisasi multistep
diikuti dengan kromatografi kolom dari cairan induk yang tersisa, hasil CUR murni adalah 88,5%.
Tentu saja fraksi campuran yang terkumpul di antara fraksi murni dapat didaur ulang ke sampel
berikutnya untuk dipisahkan pada kolom. Kemurnian setiap fraksi yang ditentukan oleh HPLC
sangat memuaskan dengan 100% untuk CUR dan di atas 98% untuk dua kurkuminoid lainnya.
Sistem HPLC yang digunakan adalah “Agilent Technologies 1260 Infinity Series” yang terdiri
dari pompa penghantar pelarut 1260 Quat, injektor manual, detektor absorbansi (lampu UV dan
lampu Vis) dan perangkat lunak Agilent ChemStation. Kolom C18 (4,6 x 100 mm) digunakan
dengan asam asetat 2% dalam air/asetonitril (60/40, v/v) sebagai fase gerak. Fase gerak baru
disiapkan, disaring dan dihilangkan gasnya setiap hari sebelum digunakan. Metodologi
eksperimental adalah; laju aliran: 1.000 ml/menit, deteksi UV multisaluran simultan pada 425 nm,
350 nm, dan 280 nm. Teknik HPLC ini digunakan untuk mengidentifikasi kemurnian setiap fraksi
kolom dan untuk mendeteksi dan menganalisis sampel CUR yang terdegradasi. Deteksi ketiga
kurkuminoid pada 425 nm dan deteksi bentuk keto dari kurkuminoid pada 350 nm. Untuk ketiga
kurkuminoid, puncak tajam (dipisahkan dari garis dasar) pada 425 nm diperoleh dalam waktu 6
menit dan urutan elusinya adalah CUR, DMC dan BDMC. Kemurnian fraksi terisolasi
kurkuminoid individu ditunjukkan pada Tabel 3.

Fase gerak yang digunakan mengandung air (60% asam asetat dalam H2O / 40% ACN
(60/40, v / v) larutan) yang memfasilitasi transformasi tautomer enol menjadi bentuk keto.
Menggunakan fase gerak dingin bersama dengan injeksi jarum cepat menunjukkan penurunan atau
hilangnya keto puncak pada 350 nm (Gambar 1). Kemudian disimpulkan bahwa puncak pada 350
nm ini disebabkan oleh bentuk keto dari CUR. Dalam percobaan HPLC, puncak tautomer keto
pada 350 nm diamati ketika percobaan dilakukan untuk CUR murni serta untuk sampel CUR
terdegradasi. Dalam pelarut polar organik seperti MeOH, tautomer enol adalah yang paling
dominan. Ini karena tautomer enol memiliki konformasi planar, yang distabilkan oleh ikatan H
intramolekul yang kuat dan konjugasi dipertahankan di seluruh molekul planar, yang
menghasilkan penyerapan UV-Vis maksimum sekitar 425 nm. Sebaliknya, tautomer keto yang
kurang stabil memiliki konformasi nonplanar di mana gugus karbonil berada pada posisi anti,
membentuk dua fragmen tidak terkonjugasi yang menghasilkan puncak serapan sekitar 350 nm.
Penambahan air menstabilkan bentuk keto seperti yang dicirikan oleh adanya bahu adsorpsi UV
pada 350 nm.
 Kurva standar kalibrasi diperoleh dengan menggunakan HPLC dengan membuat stok
kurkuminoid individu yang disiapkan/dimurnikan dan produk degradasi yang diketahui (Vanillin
dan asam vanilat) dalam asetonitril. Linearitas kurva kalibrasi, faktor kalibrasi dan kesalahan
validasi metode analisis yang dikembangkan disajikan pada Tabel 2. Semua kurva kalibrasi dari
ketiga kurkuminoid menunjukkan linearitas yang baik dalam rentang uji (R2=0,999). Metode ini
menunjukkan reproduktifitas yang baik asalkan sampel dianalisis setelah penyimpanan dalam
kegelapan menggunakan pelarut H2O/ACN hingga 24 jam (MREV < 3%).
V. Simpulan

Mengikuti langkah pertama kristalisasi berulang untuk menghasilkan kurkumin murni

(CUR), cairan induk yang tersisa berhasil diolah dengan kromatografi kolom gel silika untuk
menghasilkan fraksi murni Demethoxycurcumin (DMC) dan Bisdemethoxycurcumin (BDMC).
Dengan menggunakan campuran kloroform dan metanol sebagai fase gerak dalam operasi
nonisokratik, fraksi murni CUR (100%), DMC (98,6%) dan BDMC (98,3%) diisolasi dengan
peningkatan bertahap konsentrasi metanol. Rendemen pada proses kormatorgrafik dari
kurkuminoid murni masing-masing adalah 81%, 79,7% dan 68,8% dari CUR, DMC dan BDMC.
Selama proses gabungan dari kristalisasi bertingkat diikuti oleh kromatografi kolom dari larutan
induk yang tersisa, hasil CUR murni adalah 88,5%. Ditemukan bahwa CUR cepat terdegradasi di
bawah kondisi cahaya dan oksidatif, sementara BDMC dan DMC lebih stabil. Kehadiran (B) DMC
dalam campuran kurkuminoid mentah meningkatkan stabilitas CUR.

VI. Daftar Pustaka

Basnet, P.; Hussain, H.; Tho, I.; Skalko- Basnet, N. J Pharm Sci. 2012, 101(2), 598-609.
Cao, Y; Xu, R.X; Liu, Z. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2014, 949 – 950, 70-
78.
Chattopadhyay, I.; Biswas, K.; Bandyopadhyay, U.; Banerjee, R.K. Current Science. 2004, 87(1),
44 - 53.
Esatbeyoglu, T.; Ulbrich, K.; Rehberg, C.; Rohn, S.; Rimbach, G. Food Funct. 2015, 6, 887 – 893.
Gupta, N.K.; Dixit, V.K. J Pharma Sci. 2010, 100(5). 1987 – 1995.
Jadhav, B.K.; Mahadik, K.R.; Paradkar, A.R. Chromatographia. 2016, 65, 7-8.
Jayaprakasha, G.R.; Rao, L.J.M.; Sakariah, K.K. J Agr Food Chem. 2002, 50(13), 3668-3672.
Kulkarni, S.J.; Maske, K.N.; Budre, M.P.; Mahajan, R.P. International Journal of Pharmacology
and Pharmaceutical Technology.2012, 1(2), 2277-3436.
Li, B.; Konecke, S.; Wegiel, L.A.; Taylor, L.S.; Edgar, K.J. Carbohyd Polym. 2013, 98, 1108-
1116
Luo, J.; Yang, M. J Therm Anal Calorim. 2014, 115, 2331-2338.
Patil, M.B.; Taralkar, S.V.; Sakpal, V.S.; Shewale, S.P.; Sakpal, R.S. International Journal of
Chemical Sciences and Applications. 2011, 2, 172-174.
Pandey, A.; Gupta, R.K.; Srivastava, R. Asian J. Applied Sci. 2011, 4, 343 – 354.
Priyadarsini, K. Molecules. 2014, 19(12), 20091
Shahani, K.; Panyam, J. J Pharma Sci. 2011, 100(7), 2599-2609.
Shen,Y; Han, C; Chen, X; Hou, X; Long, Z. J Pharm Biomed Anal. 2013, 81-82, 146-150.
Singh, R.P.; Jain, D.A. Int. J. of Pharm. & Life Sci. 2012, 3(1), 1368-1376
Ukrainczyk, M.; Hodnett, B.K.; Rasmuson, Å.C. Org. Process Res. Dev. 2016, 20(9), 1593– 1602
Wang, Y-J; Pan, M-H; Cheng, A-L; Lin, L-L; Ho, Y-S; Hsieh, C-Y; Lin, J-K. J Pharm Biomed
Anal. 1997, 15, 1867-1876.
Wichitnithad, W.; Jongaroonngamsang, N; Pummangura, S.; Rojsitthisak, P. Phytochem Analysis.
2009, 20(4), 314-319.
Yuan, K; Weng, Q; Zhang, H; Xiong, J; Xu, G. J Pharm Biomed Anal. 2005, 38, 133-138.