HPLC (HIGH PERFORMANC

LIQUID CROMATHOGRAPHY
Disusun Oleh : Kelompok 1
 1. Rafika Chandra (200205073)

2. Novia Rahma Dita (200205079)

NAMA 3. Ashilah Haura Arnel (200205096)

ANGGOTA 4. Lilian Rahma Dayani (200205092)

5. Audrey Yolanda Huda (210205060)

6. Nurul Syafinaz (210205055)
 1. Pengertian

2. Prinsip kerja alat

3. Sketsa, gambar dan komponen-

ISI komponen alat

PRESENTASI 4. Aplikasi/penerapan HPLC

5. Contoh penggunaan alat pada

pengujian sampel
6. Kesimpulan
 PENGERTIAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran zat menggunakan fase
gerak dan fasediam, dimana pemisahan terjadi akibat adanya perbedaan daya
adsorpsi, kelarutan, partisi,ukuran molekul, ukuran ion dan tekanan uap pada
komponen yang dibawa oleh fase gerak melalui fase diam (Dong, 2006 ; Lux,
2004).
Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa
zat padat atau zat cair .Sedangkan High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang
sering disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) mulai dikembangkan pada akhir tahun 1960-
an dan awal tahun 1970-an merupakan pengembangan terkini dari kromatografi cair kolom
klasik,dimana pada KCKT ini terdapat pengembangan teknologi pada kolom, detektor yang lebih
sensitif dan peka serta kemajuan teknologi pada pompa bertekanan tinggi yang menyebabkan
KCKT menjadi suatu metode dengan sistem pemisahan zat yang cepat dan efisien (Johnson,1991).
 PRINSIP KERJA ALAT
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya
untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati
pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan
fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter <
golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.
 HPLC dengan prinsip kromatografi banyak
digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu
antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi
cair-cair.
APLIKASI Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan
kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
DAN kolom butiran berlapis zat berpori.
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat
PENERAPAN dipisahkan dengan rezin ZipaxSAX.
Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut
HPCL dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul
polimer dan masalah-masalah biokimia.
Dapat digunakan untuk memurnikan dan
mengidentifikasi suatu senyawa.
GAMBAR ALAT
 KOMPONEN ALAT

1
Injeksi sampel
Injeksi sampel seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak
bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena
proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi
gas.

Waktu retensi

2 Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom

menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu
 LANJUTAN
c. Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati

3
kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu
penggunaan serapan ultraviolet.Banyak senyawa-senyawa organik
menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jumlah cahaya
yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang
melewati melalui berkas pada waktu itu

d. Interpretasi output dari detector

4 Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana

masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang
melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol
kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh
 CONTOH PENGGUNAAN ALAT
PADA SAMPEL PENGUJIAN
Metode : Pemeriksaan selanjutnya adalah identifikasi kuantitatif menggunakan teknik HPLC.
Penentuan panjang gelombang kuarsetin dilakukan dengan me-running larutan kuarsetin
dengan konsentrasi serial 1-2,5-5-7,5 dan 10 ppm, menggunakan spektrofotometri dengan UV
370 nm. Fase diam berupa silika C-18 (25mm). fase gerak berupa air dan asetonitril dengan
flow rate 1 mm/menit. Volume sampel yang digunakan 10 µl selama 30 menit. Pengujian
dilakukan dengan uji larutan standar dan ekstrak ke dalam HPLC. Hasil HPLC terlihat pada
pengamatan pola puncak HPLC, akan terlihat nilai AUC pada Rt standar. Penghitungan hasil
menggunakan kurva kalibrasi dalam persamaaan y=ax + b.

Hasil : apat perubahan warna dibawah sinar ultraviolet 254 nm dan 365 nm. Pada sinar
ultraviolet 254 nm, hasil KLT positif pada pada Rf 1=0,53, Rf 2=0,68, Rf 3= 0,75, Rf 4=0,84,
Rf 5=0,99. Pada sinar ultraviolet 356 nm, hasil KLT positif Rf = 0, 53. Bercak positif yang
mengandung kuarsetin adalah bercak pada Rf = 0, 53, sehingga dapat dinyatakan
bahwa Aloe vera barbadensis miller mengandung kuarsetin. Hasil pemeriksaan KLT
terlihat pada gambar 1 dan
 CONTOH PENGGUNAAN ALAT
PADA SAMPEL PENGUJIAN
Metode : Penetapan kurva kalibrasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah dengan cara
sejumlah 20 µL dari masing masing seri konsentrasi larutan baku diinjeksikan ke dalam sistem
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dengan kecepatan alir 2,0 mL/menit selama
3 menit pada detektor UV 274 nm.

Hasil : Berdasarkan analisis kadar kafein yang diperoleh, dalam satu sampel
menghasilkan kadar kafein yang berbeda-beda tiap replikasinya. Namun
berdasarkan nilai CV masing-masing sampel yang dihasilkan, tidak terdapat nilai CV
yang melebihi 15%.
 KESIMPULAN
HPLC merupakan teknik pemisahan yang paling banyak digunakan
karena memiliki kelebihan dalam hal sensitivitas, selektivitas, sesuai
untuk pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap ataupun
senyawa yang termolabil yang tidak dapat dianalisi dengan
menggunakan kromatografi gas, dan penggunaan untuk analit yang
luas meliputi: asam amino, protein, asam nukleat, hidrokarbon,
karbohidrat, terpenoid, obat – obatan, pestisida, antibiotik, steroid,
senyawa metal-organik, dan senyawa anorganik (Skoog dkk, 2007).
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase
terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase
geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Terima
kasih!