HPLC

(High Performance Liquid

Chromatography)

Kelompok 2 (S1-3C)
Anggi Wahyu Rintiani (1801084)
Ayu Indah Ramadhani (1801088)
Dwi Nurma Yunita (1801091)
Jessica Julia George (1801098)
Miftahul Jannah (1801101)
Nasya Aprilla Narvieko (1801104)
Reni Amaliah (1801112)
Venny Fajriati (1801119)

Dosen Pengampu : Armon Fernando, M. Si., Apt

 Pengertian HPLC

High performance liquid

chromatography (HPLC) adalah
suatu alat teknologi kimia modern
yang digunakan untuk
menentukan komponen dalam
suatu sampel dengan metode
pememisahkan komponen
berdasarkan interaksi antara fase
gerak dan fase diam.
 • HPLC = salah satu metode kromatografi
Jenis cair (liquid chromatography)

• Prinsip: “Pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya”

• fase gerak= zat cair
PRINSIP
KERJA
• Fase diam= kolom

• Disebut = Kromatogram
Hasil
 Jenis-jenis HPLC
1.Kromatografi Adsorbsi

2.Kromatografi fase terikat

3.Kromatografi penukar ion

4.Kromatografi Pasangan ion

5.Kromatografi Eksklusi Ukuran

6.Kromatografi Afinitas
 Prinsip Kerja HPLC

• Prinsip kerja dari HPLC

adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya.

• Adapun prinsip kerja dari alat HPLC

adalah ketika suatu sampel yang akan
diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka
sampel tersebut kemudian akan terurai
dan terpisah menjadi senyawa-senyawa
kimia (analit) sesuai dengan perbedaan
afinitasnya.
 Prinsip Analisa Sampel HPLC

• Pada prinsipnya
kerja HPLC adalah
sama yaitu pemisahan
analit-analit 1.Interpretasi
1.Injeksi 1.Waktu
berdasarkan sampel retensi
1.Detector output dari
detector
kepolarannya, alatnya
terdiri dari kolom
(sebagai fasa diam)
dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya.
Komponen HPLC dan
Fungsinya
Instrumentasi HPLC

1. Fase Gerak
• Fase gerak pada HPLC harus menggunakan
pelarut dengan kemurnian sangat tinggi, ex:
Methanol for HPLC
 2. Pompa (Sistem Penyalur Fasa
Gerak)

• Pompa yang digunakan dalam HPLC

haruslah pompa bertekanan tinggi
agar dapat mendorong fase gerak
dalam reservoir menuju kolom fase
diam dan melewati detektor
 3. Injektor (penyuntikan sampel)
• Injektor merupakan
tempat masuknya sampel
ke dalam sistem HPLC.
Proses injeksi dapat
dilakukan secara manual
dengan syringe atau
dengan menggunakan
sistem injeksi otomatis.
Injektor pada HPLC harus
dapat menampung sampel
cairan dalam kisaran
volume 0.1-100 µL.
 4. Kolom dan Fase Diam
• Kolom HPLC adalah bagian
terdapat fase diam sbg
tempat pemisahan
komponen sampel.
• Kemudian dihitung waktu
retensi (tR) masing-masing
komponennya oleh
detektor.
• Waktu retensi (Time
Retention/tR) adalah waktu
yang dibutuhkan oleh
senyawa komponen sampel
untuk melewati kolom
menuju detektor.
LANJUTAN...

4. Kolom dan Fase Diam

• Fase diam biasanya adalah
Oktadesil silika (ODS atau C18)
merupakan fase diam paling
sering digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa
denngan kepolaran yang rendah,
sedang maupun tinggi.
 5. Detektor

• Berfungsi untuk
mendeteksi keberadaan
komponen yang telah
melewati kolom dan
memberikan sinyal
elektronik pada
pengolah data.
 Kelebihan HPLC
1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang
tinggi.

2. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

3. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

4. Kolom dapat digunakan kembali

5. Waktu analisa cukup singkat.

6. Kecil kuantitasnya

7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

 Kekurangan HPLC
1. Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

2. Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

3. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam

dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih
mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci
dan kemurnian larutan harus dijaga.
 Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat
dalam Plasma Kelinci (Lepus curpaeums) secara Simultan

Penelitian menggunakan metode HPLC untuk

menetapkan aspirin sebagai senyawa tunggal
atau penetapan aspirin bersama dengan asam
salisilat. Penelitian ini bertujuan untuk
menentukan beberapa parameter validasi
penentuan kadar aspirin dan asam salisilat
dengan metode HPLC serta kemanfaatannya
pada uji farmakokinetik aspirin setelah
diberikan secara intravena.
 Metode
Penentuan sistem HPLC Untuk memperoleh derajat
pemisahan (Rs) yang baik untuk aspirin, asam
salisilat, dan asam benzoat maka dikembangkan
penggunaan beberapa fase gerak, yaitu pertama
metanol : asetonitril : dapar fosfat 20 mM pH 3,5
dengan perbandingan 15:15:70; 10:20:70; dan
0:30:70 v/v, dan kedua menggunakan asetonitril :
dapar fosfat 20 mM (30 : 70 v/v) dengan variasi pH
dapar fosfat 20 mM yaitu: 3,5; 3,0; dan 2,5.
Analisis sampel dengan HPLC menggunakan kolom
LiChroCART 250 x 4,6 mm i.d., 5 µm, Purospher Star
RP-18 Endcapped (Merck), volume injeksi 20 µL,
kecepatan alir 1,5 mL/menit, dan detektor UV-Vis λ
230 nm.
Hasil Pengamatan
Dalam komposisi fase gerak ini, asam salisilat mempunyai
kelarutan yang lebih rendah dibandingkan asam benzoat dan
aspirin. pH dapar fosfat dalam fase gerak mempengaruhi
terjadinya disosiasi sehingga mempengaruhi polaritas analit.
Asam salisilat (pKa = 3) dengan pH 3,5 lebih banyak berada
dalam bentuk terionkan sehingga meningkat kelarutannya
dalam fase gerak yang relatif polar. Asam benzoat (pKa = 4,2)
lebih banyak berada dalam bentuk molekul, sehingga lebih
bersifat non polar. Sementara itu, aspirin berada dalam
persentase yang seimbang antara bentuk molekul dan
terionkan. Oleh karena itu, dalam kolom C18 secara
berturut-turut TR analit adalah asam salisilat, aspirin, dan
asam benzoat
Pada menit awal kadar aspirin dalam darah sangat tinggi,
namun segera mengalami penurunan kadar yang sangat
tajam karena sebagian besar aspirin mengalami hidrolisis
menjadi asam salisilat setelah pemberian secara
intravena yang menunjukkan bahwa penurunan kadar
aspirin diikuti dengan kenaikan kadar asam salisilat dalam
darah. Bahkan asam salisilat merupakan senyawa yang
lebih dominan di dalam darah dibandingkan aspirin.