Materi Pretest Percobaan 4 HPLC

1. a. Jelaskan prinsip kerja HPLC

 Pada dasarnya HPLC merupakan perkembangan dari metode kromatografi

kolom. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor
dan direkam dalam bentuk kromatogram.

b. Jelaskan mengenai jenis jenis HPLC yaitu HPLC fase normal dan HPLC
fase terbalik

 1. Fase normal : Pemisahan komponen sampel pada fase normal dan

fase terbalik dilakukan berdasarkan polaritas. Pada jenis HPLC ini, fase
diamnya bersifat polar (silika murni atau gugus senyawa organik seperti
amino atau siano yang terikat pada basis silika). dan fase geraknya bersifat
non polar ( seperti heksana atau heptana yang sedikit dicampur dengan
senyawa polar seperti metanol, etanol, ataupun isopropanol). Dengan
demikian, komponen sampel yang bersifat lebih polar akan berinteraksi lebih
kuat dengan fase diam (polar) sehingga membutuhkan waktu lebih lama
untuk melewati kolom dibandingkan dengan komponen sampel yang bersifat
kurang polar.

2. fase terbalik : Pada jenis ini, fase diam yang digunakan bersifat non-
polar dan fase geraknya bersifat polar. Fase diam yang digunakan pada fase
ini biasanya merupakan hidrokarbon alkil non polar seperti rantai C-8. yang
terikat pada basis silika. Fase gerak yang kerap digunakan pada fase terbalik
adalah campuran air dengan pelarut polar lain seperti Metanol, Asetonitril,
atau Tetrahidrofuran. Pemisahan terjadi karena komponen sampel yang
bersifat kurang polar akan melewati kolom lebih lama dibandingkan
komponen sampel yang bersifat lebih polar.

c. Sebutkan beberapa contoh penggunaan metode HPLC (maksudnya

pengaplikasian metode HPLC ini utk apa analisis apa aja)

 Dalam bidang farmasi, HPLC dapat digunakan untuk menguji stabilitas

obat, uji disolusi, serta quality control. Sedangkan pada industri makanan
dan minuman, HPLC dapat digunakan pada beragam analisis seperti untuk
analisis keberadaan senyawa polisiklik, analisis kadar gula dan pengawet,
atau pengukuran kualitas minuman ringan dan air. Pada bidang lain, HPLC
dapat pula digunakan untuk analisis antibiotik dalam darah, analisis kokain
pada urin, dan sebagainya.
2. Skema alat HPLC, penjelasan masing masing komponen alat nya serta
mekanisme kerjanya

Larutan sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fase gerak
(1) melewati fase diam pada kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh
detektor (6) dan ditampilkan pada pengolah data (7) sebagai kromatogram.

1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut

 Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan
kemurnian sangat tinggi. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan
fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung.

2. Pompa
 pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah pompa bertekanan
tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom fase
diam dan melewati detektor.

3. Injektor
 Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem
HPLC. Proses injeksi dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau
dengan menggunakan sistem injeksi otomatis

4. Sampel
 Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat
bening dan tidak ada endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan
sebelum dianalisis, misalnya dengan melakukan filtrasi sampel.

5. Kolom HPLC
 Di dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen sampel yang
kemudian dapat dihitung waktu retensi masing-masing komponennya oleh
detektor.

6. Detektor
 Alat ini berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang
telah melewati kolom dan memberikan sinyal elektronik pada pengolah data.

7. Pengolah Data
 Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang
terbaca oleh detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram
menggambarkan jumlah komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak
(peak) yang dihasilkan.
3. a. Jelaskan mengenai jenis jenis fase gerak/eluen dalam HPLC
 Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang
paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut pelarut jenis alkohol.

b. Sebutkan syarat-syarat fase gerak/eluen yang digunakan dalam HPLC

 - murni, tanpa cemaran
- tidak bereaksi dengan kemasan
- sesuai dengan detektor
- dapat melarutkan sampel
- mempunyai viskositas rendah
- bila di perlukan, memudahkan “sample recovery”
- harganya wajar

4. Sebutkan dan jelaskan mengenai:

a. Jenis jenis detektor
 Terdapat beberapa jenis detektor HPLC tergantung dari karakteristik yang
hendak dibaca

 detektor jenis UV-vis : karakteristik yang dibaca oleh detektor adalah

absorbansinya
 detektor indeks bias : yang mampu memberikan respon pada setiap
perbedaan indeks bias antara zat terlarut dengan fase gerak nya.
 Fluoresensi : mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus
menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar
 detektor elektrokimia : didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi.

b. Jenis jenis kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu
1. kolom konvensional :
2. kolom mikrobor

Waktu pengumpulan: max Kamis, 10 Desember pukul 14.00 WIB