LAPORAN PRAKTIKUM

ANALISIS INSTRUMENTASI
PERCOBAAN VI
PENGENALAN INSTRUMEN KROMATOGRAFI

Nama : Febrianti Harahap

NIM : V3720023
Tanggal Praktikum : Kamis, 11 November 2021
Asisten Praktikum : Putri Indah Nurani

PROGRAM STUDI D3 FARMASI

SEKOLAH VOKASI
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2021

PERCOBAAN VI
 PENGENALAN INSTRUMEN KROMATOGRAFI

I. Tujuan
1. Mengetahui bagian – bagian instrumen HPLC beserta fungsinya.
2. Mengetahui cara kerja instrumen HPLC.

II. Tinjauan Pustaka

HPLC adalah teknik pemisahan serbaguna dengan banyak aplikasi, tetapi
prosesnya terkadang kritis karena banyaknya variabel yang harus disesuaikan
dengan benar. Pemisahan HPLC setiap entitas kimia dari campuran sampel
didasarkan pada afinitas yang berbeda untuk adsorben dalam kolom atau fase
gerak, menyebabkan konstituen yang berbeda bergerak dan terpisah pada laju
yang berbeda. (Sahu dkk, 2018).
HPLC juga digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur senyawa
selama pengembangan obat dan telah digunakan di seluruh dunia selama
beberapa dekade. Efisiensi, kecepatan, peningkatan throughput, dan
pengurangan biaya analisis adalah fitur utama HPLC. Tujuan penggunaan
HPLC adalah untuk memisahkan molekul dalam waktu sesingkat mungkin,
sehingga penting untuk meningkatkan hasil analisis dan mengurangi waktu
analisis. Metode paling sederhana yang tersedia untuk mempersingkat proses
analisis adalah dengan memperpendek panjang kolom dan meningkatkan
kecepatan aliran. Namun, pendekatan ini bisa berisiko karena campuran
senyawa kompleks tidak akan terpisah dengan baik dan efisiensi kolom akan
jauh lebih rendah. Cara kedua untuk mempersingkat waktu analisis adalah
dengan mengurangi ukuran partikel. (Annisa dkk, 2019).
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) atau high performance liquid
chromatography (HPLC) adalah salah satu alat yang digunakan untuk teknik
analisis kualitatif, kuantitatif, pemisahan/isolasi dan pemurnian. Kromatografi
pertama kali ditemukan oleh Tsweet pada tahun 1903, di mana Tsweet
berhasil memisahkan pewarna Tsweet, juga menciptakan istilah kromatografi
untuk menggambarkan daerah warna yang bermigrasi ke bawah kolom. HPLC
menggunakan dua fase kerja, yaitu fase gerak dan fase diam. Fase gerak
 adalah cairan atau pelarut yang digunakan untuk membawa komponen-
komponen campuran ke detektor, sedangkan fase diam adalah fase diam
dalam kolom yang berupa partikel berpori kecil dengan luas permukaan
spesifik yang besar. (Angraini dan Desmaniar, 2020).

III. Gambar Alat Utama dan Mekanisme Kerjanya

Proses analisis kromatografi dimulai dengan injeksi sampel yang mengandung

analit terlarut ke dalam injektor. Analit dan fase gerak dipompa melalui kolom
dan komponen dipisahkan dalam kolom. Setiap komponen dielusi dari kolom
dan akan muncul sebagai puncak yang terlihat dalam sistem pemrosesan data.
Detektor akan merespon setiap komponen yang ditampilkan pada grafik yang
dapat dilihat pada perekam atau layar komputer yang disebut kromatogram.
(Leba, 2017)

IV. Pembahasan
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk Mengetahui bagian – bagian
instrumen HPLC beserta fungsinya dan mengetahui cara kerja instrumen
HPLC. Prinsip dasar HPLC adalah memisahkan analit menurut
polaritasnya, perangkat terdiri dari kolom (sebagai fase diam) dan larutan
tertentu sebagai fase gerak. Apa yang membedakan HPLC dari
kromatografi lainnya adalah bahwa HPLC menggunakan tekanan tinggi
 untuk mengeluarkan fase gerak. Campuran analit akan terpisah tergantung
pada polaritasnya dan laju mencapai detektor (waktu retensi) akan
bervariasi, yang akan diamati dalam spektrum di mana puncak dipisahkan.
(Sukma dan Fajri, 2019).
HPLC memiliki beberapa komponen, yaitu pompa, injector, kolom,
detector, eluent, dan recorder.
a. Pompa
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui
kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan
(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam
elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil,
bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran
reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak
berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
b. Injektor
Berfungsi sebagai tempat memasukkannya sampel dna kemudian
didistribusikan ke kolom, ada 3 jenis, yaitu stop fluoro, septum, dan loop
valve. Terdapat tiga dasar injector yang dapat digunakan, yang pertama
yaitu stop flow, kemudian septum, dan loop valve.
c. Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
Berfungsi memisahkan ion2 yag ada dalam sampel. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok, yaitu kolom analitik dan kolom preparative.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
d. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis
 kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan
(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons
untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran
dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat
diperoleh.
e. Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak
selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah
mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat
pada kolom.
f. Recorder
Berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang masuk dan
menampilkan hasil pemisahan kromatografi (Putra, 2004).
Analisis HPLC memiliki beberapa keunggulan seperti kemudahan
penggunaan dan kapasitas pemisahan yang tinggi, yang menjadikannya metode
untuk penentuan molekul senyawa organik. Selain itu, deteksi senyawa PAH
terutama dilakukan dengan instrumen HPLC dibandingkan dengan kromatografi.
Dari segi kecepatan, HPLC dapat memberikan hasil yang akurat dan mengurangi
limbah dengan cepat, dari segi sensitivitas pendeteksian ion dalam sampel baik,
walaupun jumlah sampel yang diinjeksikan ke dalam kolom pemisahan sangat
rendah, maka dari segi selektivitas filtrasi. pemisahan dapat dilakukan atas dasar
keinginan, misalnya kation/anion, hanya kation/anion organik atau anorganik
yang dipisahkan. Selain keuntungan tersebut, HPLC juga memiliki kelemahan
yaitu seringkali sulit untuk mengidentifikasi dengan presisi semua puncak
kromatografi pemisahan. Hal ini terutama berlaku untuk kromatogram senyawa
PAH di mana puncaknya tumpang tindih, memungkinkan hasil keseluruhan dari
identifikasi molekul yang salah. (Hirjani dkk, 2018).
HPLC dapat dibedakan menjadi dua, yaitu fase normal dan fase balik. Fase
normal adalah teknik fase gerak yang kurang polar atau nonpolar dan fase diam
yang lebih terpolarisasi. Dalam teknik ini, sampel dengan polaritas lebih rendah
dielusi lebih awal. Fase terbalik adalah fase yang lebih polar akan terdisosiasi
terlebih dahulu dan memiliki waktu retensi yang lebih cepat dibandingkan dengan
 fase nonpolar (Aulia et al, 2016). Kemudian ada dua jenis komponen eluat yaitu
elusi isometrik dan elusi gradien. Elusi isokratik terjadi jika komposisi fase gerak
yang digunakan selama analisis selama sama atau tetap. Fade gerak yang
digunakan dengan komposisi yang sama selama proses pemisahan (cocok untuk
sampe yang sedikit). Sedangkan elusi gradien terjadi jika komposisi fase gerak
yang digunakan berubah ubah selama analisis . Fase gerak tersebut berubah
komposisinya terhadap waktu, tergantung pada pemisahannya (cocok untuk
sampel yang banyak). Sistem elusi gradien bisa memisahkan berbagai komponen
(seperti komponen yang kompleks). Larutan yang sebelum diinject ke kolom
harus mengalami proses penyaringan terlebih dahulu. Fungsi penyaringan larutan
sebelum diinject ke kolom yaitu untuk menyaring partikel atau komponen lain
yang kemungkinan masih terkandung dalam larutan uji dan standar sehingga
dengan penyaringan ini pula maka kerusakan kolom dapat terhindar. Tekanan
pada HPLC dipengaruhi oleh besar aliran dari pompa, tipe dari kolom, ukuran
partikel adsorban dalam kolom (mesh) dan panjang kolom yang digunakan.
Kemudian jika fase gerak bersifat non polar dan fase diam bersifat polar maka
analit yang akan terelusi atau keluar dari kolom terlebih dahulu yaitu zat yang non
polar dahulu. Sedangkan jika fase gerak bersifat polar dan fase diam bersifat non
polar maka analit yang akan terelusi atau keluar dari kolom terlebih dahulu yaitu
yang polar dahulu.
V. Kesimpulan
HPLC memiliki beberapa komponen yaitu pompa yang mendorong fase gerak
ke dalam kolom, injektor sebagai tempat memasukkan DNA ke dalam sampel
dan kemudian mendistribusikannya ke kolom, kolom memiliki fungsi
memisahkan ion-ion dalam sampel, fungsi detektor adalah untuk membaca ion
yang melewati detektor (kualitatif).) dan untuk menghitung kadar (kuantitatif),
elusi gradien sehingga memungkinkan untuk meningkatkan intensitas fase
gerak selama l kromatografi analisis dan perekam dengan fungsi perekaman
dan pemrosesan. data yang masuk dan melihat hasil pemisahan kromatografi.
Mekanisme kerja dalam HPLC adalah bahwa analit dan fase gerak dipompa
melalui kolom dan komponen dipisahkan dalam kolom. Setiap komponen
dielusi dari kolom dan akan muncul sebagai puncak yang terlihat dalam sistem
 pemrosesan data. Detektor kemudian merespon setiap komponen yang
ditampilkan pada grafik yang dapat dilihat pada perekam atau layar komputer
yang disebut kromatogram.

VI. Daftar Pustaka

Angraini, Novi., dan Desmaniar, Putri. 2020. Optimasi Penggunaan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) Untuk Analisis Asam
Askorbat Guna Menunjang Kegiatan Praktikum Bioteknologi
Kelautan. Jurnal Penelitian Sains, 22(2) : 69 – 75.
Annisa, Safira., Musfiroh, Ida., Indriati, Lina. 2019. Perbandingan Metode
Analisis Instrumen HPLC Dan UHPLC : Article Review. Jurnal
Farmaka, 17(3) : 190 – 197.
Aulia, Savira, S., Sopyan, Iyan., dan Muchtaridi. 2016. Penetapan Kadar
Simvastatin Menggunakan Kromatorafi Cair Kinerja Tinggi
(Kckt) :Review. Jurnal Farmaka, 14(4) : 70 – 78.
Hirjani., Pranowo, Harno, D., Mudasir. 2018. Prediction of High Performance
Liquid Chromatography Retention Time for Some Organic
Compounds Based on Ab initio QSPR Study. Acta. Chim. Asiana,
1(1) : 24 – 29.
Leba, M, A, U. 2017. Buku Ajar Ekstraksi dan Real Kromatografi.
Yogyakarta: Penerbit Deepublish.
Putra, De LuxE. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang
Farmasi. Medan : USU Digital Library.
Sahu, Prafulla, K., Ramisetti, Nageswara, R., Cecchi, Teresa., Swain,
Suryakanta., Patro, Chandra, S., dan Panda, Jagadesh. 2018. An
overview of experimental designs in HPLC method development and
validation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
147 : 590 – 611.
Sukma, Fisca, F., dan Fajri, Rahmatul. 2019. Identifikasi Asam Dehidroasetat
dalam Produk Kosmetika dengan Menggunakan HPLC (High
Performance Liquid Cromatography). Jurnal Kimia Sains Dan
Terapan, 1(2) : 15 – 17.
VII. Lampiran
1. Abstrak Jurnal dan bagian yang disitasi
2. Dokumentasi
3. Jawaban Pertanyaan

Mengetahui Surakarta, 17 September 2021

Asisten Praktikum, Praktikan,

(Putri Indah Nurani) (Febrianti Harahap)

Lampiran
1. Abstrak Jurnal dan bagian yang disitasi
2.
3. Dokumentasi
4. Jawaban Pertanyaan
1) Jelaskan prinsip kerja HPLC!
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan
 HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (Sukma dan Fajri, 2019).
2) Berdasarkan komponen fase geraknya, HPLC dibagi menjadi berapa
bagian? Sebutkan dan jelaskan perbedaannya!
-Fase normal adalah teknik fase gerak yang bersifat kurang polar atau
non polar dan fase diam bersifat lebih polar. Pada teknik ini sampel
yang memilki tingkat kepolaran lebih rendah akan terelusi lebih awal.
-Fase terbalik adalah zat yang lebih polar akan terelusi lebih dulu dan
memiliki waktu retensi yang lebih cepat dibanding zat non polar (Aulia
dkk,. 2016).
3) Sebutkan bagian-bagian HPLC dan jelaskan fungsinya!
1. Eluent atau fase gerak berfunsgi sebagai fase gerak yang membawa
sampel kedalam kolom pisah
2. Pompa berfungsi mendorong fase gerak masuk ke kolom dengan
tekanan sampai 600 psi, kecepatan alir 0,1-100 ml/ menit
3. Injektor berfungsi sebagai tempat memasukkannya sampel dna
kemudian didistribusikan ke kolom, ada 3 jenis, yaitu stop fluoro,
septum, dan loop valve.
4. Kolom pemisahan lain berfungsi memisahkan ion2 yag ada dalam
sampel
5. Detektor berfungsi membaca ion yang lewat dalam detektor
(kualitatif) dan menghitung kadarnya (kuantitatif)
6. Recorder data berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang
masuk dan menampilkan hasil pemisahan kromatograf
4) Jelaskan analit yang terelusi lebih dahulu pada HPLC fase normal dan
fase terbalik!
-Pada fase normal: Fase diam polar, artinya F geraknya kurang polar,
jika difase diamnya polar maka zat yang bersifat polar akan tertahan
lebih lama.
 -Pada fase terbalik: Fase diam kurang polar, artinya F geraknya polar,
jika difase diamnya kurang polar maka zat yang bersifat polar akan
terelusi lebih cepat.
5) Sebutkan data yang disajikan pada kromatogram!
Dari data kromatogram yang disajikan terdapat kandungan senyawa
Clopidogret dengan memiliki retention time (Rt) = 2.718 menit dan
0,43 AU