PERCOBAAN 2

TEKNIK UJI AKTIVITAS ANTI BAKTERI

I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu melakukan uji aktivitas antibakteri.
2. Mahasiswa mampu menentukan konsentrat hambat tumbuh minimum
(KHTM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) dari senyawa antibakteri.

II. Landasan Teori

Antibakteri adalah zat yang menekan pertumbuhan atau reproduksi
bahkan membunuh bakteri. Antibakteri terbagi atas dua berdasarkan
mekanisme kerjanya, yaitu bakteriostatika yang bersifat menghambat
pertumbuhan bakteri dan bakterisida yang bersifat membunuh bakteri.
Antibakteri dapat memiliki aktivitas bakteriosatika menjadi aktivitas bakterisida
apabila kadarnya ditingkatkan melebihi kadar hambar minimal (KHM). Target
mekanisme antibakteri yaitu perusakan dinding sel, pengubahan permeabilitas
sel, penghambatan kerja enzim, penghambatan sintesis asam nukleat dan
protein, dan pengubahan molekul protein dan asam nukleat (Rollando, 2019).
KHM adalah konsentrasi minimal zat antimikroba yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh
koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati banyaknya koloni bakteri
yang tumbuh. KHM juga merupakan teknik untuk menentukan konsentrasi
minimum zat antimikroba yang dibutuhkan dalam menghambat pertumbuhan
suatu mikroorganisme. Konsentrasi hambatan minimum (KHM) menyatakan
bahwa prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi antibiotik yang
masih efektif untuk mencegah pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis
antibiotik yang efektif yang digunakan untuk mengontrol infeksi yang terjadi pada
pasien (Saputera et al., 2019).
Hasil uji aktivitas antibakteri pelarut etanol menunjukkan dapat
menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif tetapi tidak dapat menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif. Hal ini dapat disebabkan oleh tingginya
konsentrasi etanol yang digunakan (>98%). Etanol absolut memiliki efek
bakterisidal yang lebih lemah dibandingkan campuran antara alkohol dan air.
Meskipun demikian, etanol pada konsentrasi 60-99% masih dapat menghambat
pertumbuhan gram negative. n-Heksan tidak menunjukkan aktivitas antibakteri
terhadap bakteri gram positif dan negatif. Aktivitas antibakteri dipengaruhi oleh
polaritas senyawa yang diekstraksi oleh masing-masing pelarut dengan
kemampuan zat tersebut untuk menyebar pada media berbeda yang digunakan
dalam pengujian aktivitas antibakteri (Fitriah et al., 2017)
III. Alat dan Bahan

A. Alat
- Autopipet
- Incubator
- pH meter
- Cawan petri
- Jarum ose
- Neraca analitik
- Spektrofotometer
- Tabung reaksi
- Pipet tetes

B. Bahan
- Bakteri (gram negative : E.coli, gram positif: Bacillus subtillis)
- Larutan baku McFarland 0.5 (BaCl2 1%, larutan H2SO4)
- Media NA
- Media NB
- Kapas
- Aluminium foil
- Akuades
- Kloramphenikol
IV. Skema Kerja
A. Pembuatan Larutan baku Mc. Farland 0,5
Larutan baku Mc.Farland terdiri dari larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1%.
Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl2 1% dicampurkan dengan 9,95 ml H2SO4
1%, dikocok hingga homogen.
Kekeruhan larutan diukur pada Panjang gelombang 450 nm dengan
menggunakan aquades sebagai blanko. Nilai adsorben larutan baku harus
berada pada kisaran 0,08 sampai dengan 0,13. Larutan baku Mc. Farland
0,5 ekuivalen dengan suspense sel bakteri dengan konsentrasi 1,5 x 10 8
CFU/ml (nilai absorban 0,138).

B. Penentuan Aktivitas Antibakteri

- Peremajaan Bakteri Uji

Peremajaan bakteri dilakukan dengan menginokulasi bakteri uji ke

dalam media NA dan diinkubasii selama 24 jam pada suhu 37 oC. Koloni
yang tumbuh pada media kemudian dipindahkan ke dalam 10 mL media
NB secara aseptic dan disesuaikan serapannya dengan larutan abku Mc.
Farland 0,5 sehingga diperoleh suspense bakteri dengan jumlah sel 1,5 x
108 CFU/ml.

- Pengujian Aktivitas Antibakteri

Senyawa antibakteri dimasukkan ke dalam sumur cawan mikro dan
diencerkan dengan berbagai konsentrasi dengan menggunakan media NB
steril. Senyawa antibakteri yang digunakan berupan antibiotic dengan
berbagi konsentrasi (0,001%, 0,01%, 1%). Kemudian sebanyak 5 μl
suspense bakteri uji yang distandarisasi jumlah sel dengan NaCl 0,85 %
dimasukkan kedalam sumur cawan mikro dan diinkubasi selama 24 jam
pada incubator 37oC. Volume total campuran senyawa antibakteri, media
NB dan suspense sel bakteri adalah 200 μl. setelah 24 jam, cawan mikro
diamani berdasarkan prinsip turbidimetri. Konsentrasi paling jernih
(tidak keruh) ditetapkan sebagai konsentrasi hambat minimum. Penetuan
konsentrasi bunuh minimum dilakukan dengan melakukan subkultur 50
μl suspense yang jernih ke dalam media NA lalu diamati setelah 24 jam.
Konsentrasi bunuh minimum adalah yang membutuhkan Sebagian besar
bakteri. Kontrol negative yang digunakan berupa media dan bakteri uji.