BAB I

Latar Belakang

1.1 Latar Belakang

HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasa diam yang
ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan
dengan cepat kedalam kolom dengan bantuan pompa / tekanan.

HPLC merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui
fase diam (stationary phase). Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak
(mobile phase) . Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda,
sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-wa dengan fase diam dan fase gerak

1.2 Tujuan
1. Agar dapat mengetahui pengertian dari alat HPLC.
2. Mengetahui komponen serta fungsi dari alat HPLC.
3. Mengetahui prinsip kerja alat HPLC.
4. Mengetahui cara kerja alat HPLC.
5. Dapat mengetahui cara kalibrasi alat HPLC.
6. Dapat mengetahui cara untuk merawat HPLC.
7. Dapat mengetahui jenis jenis alat HPLC.
 2

BAB II

Pembahasan

2.1 Pengertian

HPLC merupakan senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang
sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram. Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi
(tR) dan luas area/tinggi puncak . Analisis kualitatif digunakan informasi tR. Analisis kuantitatif
digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogram

2.2 Keuntungan HPLC

1. Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam proseduran alisis dan pengolahan data
2. Volume sampel kecil
3. Daya pisah tinggi
4. Merupakan metode analitis cepat, responsive, akurat, tepat, reproducible
5. Preparatif
6. Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile dan non-
volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.
7. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

2.3 Kekurangan HPLC

1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dg spektrometer

massa
2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit
diperoleh
 3

2.4 Bagian Atau Komponen HPLC

1. GradienController/Solvent Reservoir :

Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan kedalam kolom
dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus dimilipore (pori-
pori+5m) dan di degass.

2. Pompa:

Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk kedalam kolom. Jenis jenis
pompa sebagai berikut :

a. Pompa bolak balik (reciprocating pump)

Paling banyak digunakan
Jumlah volume pelarut tidak terbatas
Dapat digunakan untuk elusi gradient
Menghasilkan aliran berpulsa
b. Pompa jenis penyuntik (syringe pump)
Kapasitas ruang pelarut 250 500 mL
Untuk kolom kolom kecil (micro bore columns)
Menghasilkan aliran bebas pulsa
 4

3. Sample Introductions/Injector :

Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan bantuan syringe.

4. Kolom:
Merupakan jantung dari system HPLC, karena didalam kolomlah terjadi pemisahan
komponen-komponen cuplikan.
5. Detektor:

Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom.

6. Data Output :

Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh.

2.5 Prinsip Kerja

Dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan melalui kolom ke detektor. Sampel yang
dilarutkan dalam solvent, dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara injeksi. Di
dalam kolom terjadi pemisahan komponen2 campuran perbedaan kekuatan interaksi
anatara analat (solut-solut) dengan stationary phase pada kolom.

Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom
terlebih dahulu. Sebaliknya, solut2 yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut2
tsb akan keuar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram GC jumlah peak menyatakan jumlah

komponen; luas area peak menyatakan konsentrasi dalam campuran

Sisitim HPLC dapat dihubungkan dengan software pada komputer dan dioperasikan secara
computerize
 5

2.6 Cara Kerja

Tahapan memasukkan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal

Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvens
2. ional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -
100 l/menit).
3. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 6

4. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya

jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.

Performance kolom menurun seiring dengan lamanya waktu penggunaan, yang ditandai
dengan peningkatan backpressure dan lebar puncak kromatogram
 7

Pengoperasian Kolom

Untuk kolom Reversed-Phase [C8, C18, fenil, dll], gunakan petunjuk berikut:

1. simpan kolom dalam asetonitril atau metanol atau campuran air dan pelarut
organik
2. jangan mengoperasikan kolom melebihi pH yang diperbolehkan (untuk kolom
berbasis silika, disarankan pH 2,5 8). pH > 8 silika terlarut. pH < 2
bonded silika terhidrolisis
3. Selalu flush (aliri) kolom dengan pelarut kuat (strong solvent) seperti metanol
sebelum digunakan untuk mengeliminasi setiap anlit yang tertahan kuat
4. Jangan pernah biarkan komponen bufer tertinggal dalam dalam pompa atau
kolom, karena komponen bufer dapat mengendap dan menimbulkan kerusakan

Pencucian Kolom
1. Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.
2. Untuk kolom Reversed-phase: gunakan campuran 96% diklorometan dan 4% metanol
dengan 0,1% amonium hidroksida
3. Untuk kolom Normal-phase: gunakan metanol
4. Pada keadaan yang sulit lakukan back-flushing kolom dengan kecepatan alir rendah

Wadah Fase gerak dan Fase gerak

1. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
2. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi.
3. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
4. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
5. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
 8

6. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
7. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
8. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau dengan cara bergradien (komposisi
fase gerak berubah-ubah selama elusi)
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas)
1. Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian tinggi (HPLC grade)
2. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

2.7 Resolusi

Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan
dalam kromatogram yang dihasilkan

Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara
sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih
 9

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

1. HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasa diam yang
ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang
dialirkan dengan cepat kedalam kolom dengan bantuan pompa / tekanan.
2. Memiliki 6 komponen yaitu : GradienController/Solvent Reservoir, Pompa, Sample
Introductions/Injector, Kolom, Detektor, Data Output.

3.2 Saran

Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh data kata sempurna oleh karena itu
penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang sifatnya membangun agar dalam pembuatan
makalah selanjutnya bias lebih baik lagi, atas perhatiannya penulis ucapkan terimakasih.