Anda di halaman 1dari 10

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

a.

Pengertian Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) .

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Diagram alir HPLC

b. Prinsip Dasar HPLC

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
c.

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu: 1. Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detector. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan fasa gerak HPLC Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut: 1. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. 2. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram. 3. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. 4. zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5. zat cair tidak kental. 6. sesuai dengan detektor. Jenis fasa gerak Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak. 2. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :

1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2) 2. Keluaran bebas pulsa 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit 4. Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic. Pompa reciprocating Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut. Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC : 1. Injeksi Syringe Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek. 2. Injeksi stop-flow Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. 3. Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5

hingga 500L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 L. 4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. 5. Detector Fungsi detektor dalam kromatografi cairan atau HPLC adalah untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom secara kualitatif dan kuantitatif bergantung kepada kebutuhan analisis. Detektor HPLC yang baik harus mempunyai sensitivitas yang cukup tinggi atau mempunyai limit deteksi yang sangat kecil, sehingga dapat memberikan perubahan sinyal yang besar pada perubahan konsentrasi komponen cuplikan yang kecil. Detektor yang sensitive akan sangat membantu analisis kualitatif maupun kuantitatif terutama untuk trace analysis. Dua jenis detektor yang dikenal di dalam HPLC adalah: Detektor universal Yaitu detektor yang bisa langsung digabungkan ke dalam instrument HPLC tanpa memerlukan tambahan system khusus. Contoh : detektor UV/Vis, detektor indeks refreksi, detektor fluorescence dan detektor hantaran. Detektor khusus Yaitu detektor yang memerlukan system khusus agar bisa digunakan sebagai detektor MS( Mass Spectrometer), dan sebagainya.

6. Recorder/ pencatat Sistem HPLC memerlukan recorder sebagai system pencatat yang berkualitas baik dan mampu dan mampu menampilkan kromatogram dengan jelas, tepat, dan cukup peka. Alat tersebut harus mampu menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu dengan noise listrik. Sesuai perkembanganya alat pencatat untuk HPLC modem juga telah berkembang cukup pesat, diantaranya adalah integrator yang selain mampu menggambarkan kromatogram dengan jelas juga langsung menghitung waktu retensi serta luas puncak dalam kromatogram. Selain itu, untuk menampilkan kromatogram hasil analisis juga bisa digunakan komputer dengan modem dan progam tertentu, sehingga dapat mencetak dan menyimpan kromatogram yang dipilih. 7. Penyambung atau union Bagian lain dari sistem HPLC yang penting adalah penyambung yang mungkin terbuat dari material stainless steel atau material lain yang inert bergantung pada kebutuhan analisis. Pipa penyambung ini harus diusahakan sependek mungkin, karena sistem penyambungan ini mempengaruhi pelebaran pita akibat dari proses difusi komponen dalam fasa gerak yang mengakibatkan pelebaran kromatogram. Ukuran pipa penyambung yang terletak antara pelarut injektor tidak terlalu riskan, dan umumnya digunakan pipa 0.75mm i.d, sedangkan penyambung setelah injektor harus lebih kecil yaitu sekitar 0.25mm i.d. Panjang dari masing-masing pipa

penyambung tersebut harus diusahakan sependek mungkin sehingga volume kosong yang terjadi mendekati nol. Selain ukuran berupa diameter dan panjangnya, penyambung tersebut harus dijaga terhadap kemungkinan terjadinya kebocoran yang berakibat mempengaruhi hasil analisa maupun kinerja system HPLC.

d. Cara Kerja HPLC Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan. Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel. e. Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah 1. dapat dilaksanakan pada suhu kamar. 2. cepat dan mudah melaksanakannya. 3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik. 4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. 5. ideal untuk molekul besar dan ion. 6. mudah memperoleh cuplikan. 7. daya pisahnya baik. 8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. 9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil. f. Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative. III. KESIMPULAN Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya, dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya Instrumentasi HPLC yaitu: 1. Fasa Gerak 2. Pompa 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel 4. Kolom 5. Detector Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.

DAFTAR KEPUSTAKAAN Drs. Soebagio dkk, 2002, KIMIA ANALITIK II, Malang: JICA FMIPA UNM Sumar Hendrayana, 2006, KIMIA PEMISAHAN, Bandung : Rosdakarya Hostettmann, K dkk, 1995, Cara Kromatografi Preparatif, Bandung: ITB N. Haden, dan F.Bauman (eds) basic liquid chromatography, varian aerograph USA, 1971 R.L Hannan (ed), pratical liquid chromatography, An introduction, the perkin-elmer corp, 1980 C.F poople, and S.A schuette, contemprorary pratice of chromatography, first edition, elsevier. Sci. Publish. Co, 1984.

MAKALAH KIMIA INSTRUMEN


(Diajukan untuk memenuhi tugas kimia instrumen ) HPLC

Oleh : Rachma Amalina Kelas : XII

SMK CHEMICA KEJURUAN ANALISIS KIMIA JL.MAHMUD NO.17 (TERUSAN PASTER) BANDUNG 2012

I.

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur saya panjatkan kehadirat tuhan yang maha esa karena saya dapat menyelesaikan tugas makalah kimia insrtumen mengenai hplc (high perfomance liquid chromatography). Penyelesaian makalah ini diharapkan dapat memenuhi nilai tugas kimia instrumen. Makalah ini dilengkapi dengan penjelasan tentang hplc, prinsip, cara kerja hplc dan aplikasi hplc dalam kehidupan sehari-hari. Makalah ini akan menjelaskan tentang hplc dan kelebihanya dibandingkan dengan kromatografi lainya. Semoga makalah ini dapat bermaanfaat bagi yang membacanya, dan saya mengharapkan kritik dan saran dari pembaca untuk meningkatkan makalah ini, karena saya yakin makalah ini belum sempurna

II . PENDAHULUAN

Sejak ditemukanya teknik pemisahan kromatografi oleh Mikhail semenovich Tsweet (1872-1919), teknik analisis kromatografi ini kemudian berkembang menjadi berbagai macam teknik pemisahan secara kromatografi yaitu kromatografi gas, kromatografi cairan, dan kromatografi plannar. Walaupun ada besar kromatogaberbagai cara untuk mengklasifisikan teknik-teknik kromatografi, dasar yang sering digunakan adalah dari penamaan fasa-fasa yang digunakan (fasa gerak-fasa diam), misalnya : gas-liquid (GLC: gas liquid chromatography), liquid-liquid (LLC: liquid liquid chromatography), liquid solid (LSC: liquid solid chromatography) dsb. Tetapi, pada dasarnya metoda kromatografi dikelompokan dengan cara : sebagian besar berdasarkan tipe fasa dan sebagian oleh mekanisme distribusi fasanya. Berdasarkan wujud fasa gerak yang digunakan, klasifikasi besar kromatografi ada dua macam yaitu: kromatigrafi gas dan kromatografi cairan. Fasa diam pada kromatografi cairan biasanya dimasukan ke dalam kolomh atau berupa bidang/plat. Yang berupa colom terdiri dari dari dua jenis yaitu kolom tertutup contohnya HPLC:high perfomance liquid chromatography/ KCKT : kromatografi kinerja tinggi, dan kolom terbuka (kromatografi cairan konvensional/ Tsweet). Kromatografi cairan planar juga terdiri dari dua jenis yaitu kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Pada makalah ini selanjutnya akan dibicarakan mengenai kromatografi cairan kolom tertutup (HPLC)