TUGAS ANALISIS SEDIAAN

“HPLC”

NAMA : RIRIN R. KOTTEN

NIM : 194111095
KELAS : FARMASI C/VIII
 HPLC singkatan dari ”High Perfomance Liquid
Chromatography” atau ”High Pressure Liquid
Chromatography”, kadang-kadang HPLC diistilahkan
LC (Liquid Chromatography) atau di Indonesia
HIGHT PERFORMANCE LIQUID diistilahkan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
CHROMATOGRAPHY (HPLC) Dari sistem peralatannya, HPLC termasuk kromatografi
kolom karena dipakai fase diam yang diisikan atau
terpacking didalam kolom. Tetapi bila ditinjau dari
pemisahannya, HPLC termasuk kromatografi adsorpsi
atau kromatografi partisi atau asas lainnya tergantung
jenis kolom yang dipakai dan analit yang ditentukan.
Jadi tergantung pada butiran-butiran fasa diam yang ada
didalam kolom apakah sebagai fasa padat murni atau
disebut cairan. Perkembangan HPLC berawal dari proses
pemisahan yang berazaskan absorpsi dari partisi ke arah
yang lebih luas yaitu proses pemisahan yang berazaskan
afinitas, filtrasi gel dan ion yang berpasangan, akan
KROMATOGRAFI CAIR
tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan didalam
KINERJA TINGGI (KCKT)
kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan
tekanan tinggi
 Maksud dan tujuan analisis dengan HPLC

Maksud dan tujuan analisis dengan HPLC hanya ada dua hal yaitu : didapatkannya
pemisahan yang baik dan proses analisis barlangsung dalam waktu relatif singkat. Untuk
tercapainya maksud dan tujuan tersebut, maka diperlukan penataan yang betul-betul sudah
dipersiapkan dan diperhitungkan antara lain:

 Dipilih pelarut pengembang atau pengembang campuran yang sesuai

untuk komponen yang dipisahkan.
 Berkaitan dengan pemilihan pelarut pengembang fasa mobil maka
kolom yang dipakai juga harus diperhatikan.
 Detektor yang memadai
 Pengetahuan dasar HPLC yang baik serta pengalaman dan
keterampilan kerja yang baik.
 Keuntungan HPLC

01 Dapat dilakukan pada suhu 04 Waktu analisis pada

umumnya singkat
kamar.

02 Kolom dan pelarut

pengembang dapat digunakan
05 Ketepatan dan ketelitiannya
yang relatif tinggi
berkali-kali

03 Detector HPLC dapat

divariasi dan banyak jenisnya
06 Mudah dioperasikan secara
otomatis
 JENIS-JENIS HPLC/KCKT
 KROMATOGRAFI ADSORBSI
• Cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat polar
• Partikel-partikel silika atau alumina bisanya digunakan sebagai adsorben
• Jenis kromatografi ini menggunakan fase gerak non polar seperti
heksana→kromatografi fasa normal.
 KROMOTOGRAFI PARTISI
• Kromotografi partisis sangat cocok untuk pemisahan senyawa senyawa non
polar → disebut juga kromotografi fase terbalik/fase terikat
• Fase diam yang digunakan silika yang dimodifikasi (oktadesilsilana,oktasila
atau fenil)
 KROMATOGRAFI PENUKAR ION
• KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapar menukar
kation/anion dengan fase gerak
 KROMATOGRAFI EKSLUSI UKURAN
• KCKT ini dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa
dengan berat molekul> 2000 Dalton
• Fase diam yang digunakan berupa silika atau polimer yang bersifat porous→
solute dapat melewati porous
Instrumen HPLC
 Wadah fase gerak
 Wadah fase gerah harus bersih dan lembam (inert)
 Wadah ini bisanya dapat menampung fase gerak antara 1-2 L
pelarut
 Sebelum fase gerak digunakan harus dilakukan degassing
(penghilang gas) yang ada pada fase gerak
 Fase gerak harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
adanya partikel-partikel kecil
 Fase gerak
 Fase gerak/eluen berupa zat cair. Selain sebagai pembawa
senyawa. Campuran menuju detector, fase gerak harus dapat
berinteraksi dengan solute-solute
 Syarat yang harus dimiliki oleh fase gerak :
• Kemurniaan tinggi
• Kesetabilan tinggi
• Kekentalan rendah
• Dapatr melarutkan sampel
• Memiliki uv-cut off rendah
 Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya,
fase gerak dibedakan menjadi 2 yaitu
• Fase normal→ fase diam lebih polar
• Fase terbalik → fase diam kurang polar
 PENGEMBANGAN (ELUSI)
 Seperti kromatografi lain, elusi adalah proses fase gerak membawa sampel
menelusuri kolom.
 Elusi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu :
• Elusi isokratik → elusi dilakukan dengan satu macam pelarut atau lebih
dengan perbandingan tetap (ex : methanol:air = 50:50%v/v)
• Elusi Bergradien → Elusi dilakukan dengan pelarut campuran yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu. (Ex : Metanol:Air =
40:60% v/v)
 Elusi Bergradien ini digunakan untuk memperoleh pemisahan (puncak) yang lebih
baik.
 ELUSI ISOKRATIK DAN ELUSI GRADIEN

 Sistem elusi isokratik memiliki kelemahan:

• Pada awal elusi mnghasilkan resolusi yg kurang baik
• Pada elusi yang lebih lanjut mnghasilkan pnambahan lebar
puncak dengan penurunan tinggi puncak
• Membutuhkan waktu analisis yang lama

 Elusi gradien memberikan beberpa kelebihan:

• Memungkinkan untuk mnghasilkan kromatogram yang ideal
• Menghasilkan resolusi yang optimum antar puncak
• Menghasilkan lebar puncak yang seragam untuk semua
puncak
• Membutuhkan waktu analisis yg lebih pndek
 Fase Diam Kolom HPLC
 Bentuk Partikel
• Bulat (spherical) atau tak beraturan (irregular)
• Partikel bulat  mengurangi tekanan dan kolom lebih
awet
 Ukuran Partikel
• Umumnya 3-10 mikro
• Makin kecil ukuran partikel, makin tinggi efisiensi
 Ukuran pori
• Bervariasi antara 60 – 10000 A
• Makin besar pori-pori  analit molekul besar dapat
tertahan lebih lama
• Pilih < 150 A untuk sampel BM < 2000
 Kolom HPLC
Kolom pada HPLC merupakan bagian yang sangat penting, sebab
pemisahan komponen-komponen sampel yang akan terjadi didalam
kolom. Oleh karena itu ada beberapa hal yang harus diperhatikan,
yaitu:
- Pemilihan kolom yang sesuai
- Pemeliharaan kolom
- Uji terhadap spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut
merupakan kolom yang siap dipakai).
Kolom HPLC yang merupakan kunci penentu keberhasilan pemisahan
komponen-komponen sampel serta hasil akhir analisis dibuat dalam
bentuk lurus (tidak dibuat melingkar sebagaimana kolom paga
kromatografi gas maupun bentuk U). Hal ini dimaksudkan untuk
efisiensi kolom, sehingga mendapatkan harga H minimal.
 MACAM MACAM KOLOM HPLC
Jenis kolom Panjang (cm) Diameter (mm) Dp (μm)
Konvensional 10-20 4,5 10
Microbore 10 2,4 5
High speed 6 4,6 3
Keterangan:
dp = diameter rata-rata fasa diam
Keuntungan : Kolom dibuat dengan diameter internal sangat kecil (kolom mikro) dengan
tujuan agar:
- kepekaan menjadi lebih teliti
- menghambat larutan pengembang
- memperluas kemampuan detektor
- sampel yang dianalisis sedikit
Kolom dibuat pendek (high speed) agar:
- menghasilkan resolusi yang baik
- memperkecil harga diameter rata-rata partikel fasa diam
- waktu tR, TM singkat (mengurangi pengaruh dari bagian instrumentasi HPLC terhadap hasil
pemisahan)

Kerugian : Kolom mikro / high speed dengan dp = 5 dan dp = 3 harus diperhatikan lebih teliti
 Pompa pada HPLC
 Pompa yang cocok digunakan pada HPLC harus inert terhadap fase gerak
 Bahan yang umum dipakai untuk pompa; gelas, baja tahan karat, Teflon, batu
nilam
 Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekananan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3ml/menit.
 Tujuan penggunaan pompa atatu sist pengantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, bebas dari gangguan
 PEMISAHAN PADA HPLC
 Setelah disuntikkan, senyawa campuran analit dipisahkan dalam kolom sebagai
pita (band) dan dalam kromatogram sebagai puncak (peak)
 Puncak dikenali berdasarkan waktu retensi
 Pemisahana didasarkan pad ainteraksi antara analit dengan fase diam dan fase
gerak
 Data:
• tR = Waktu retensi (retention time)  parameter kualitatif
• Luas puncak = Peak area  parameter kuantitatif
• Tinggi puncak (Peak height)  parameter kuantitatif

 tM = t0 adalah waktu retensi fase gerak dari injektor sampai detektor

 tR` = tR – tM = waktu retensi terkoreksi = adjusted/corrected retention time
 TAILING FACTOR (TF) & ASYMETRY FACTOR (AS)

 Tailing Factor (TF) = Symetry Factor (USP)

• Faktor ikutan
• Umum digunakan pada analisis farmasi
• Dihitung posisi 5% dari tinggi maksimum puncak
• TF = 1,0  puncak simetri
• TF <0,5  Fronting
• > 2,0  tailing
 METODE ANALISIS HPLC
HPLC dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap sampel yang
diamati:
 Analisis kualitatif  Analisis Kuantitatif
Mengacu pada : Dapat dilakukan secara sepihak, artinya tanpa mengacu
· Waktu tambat puncak kromatogram analit pada zat standar acuan, atau dapat pula dilakukan
yang dianalisis perbandingan dengan zat standar acuan sebagai standar
· Pemurnian zat yang dianalisis dan internal dan eksternal.
melanjutkan dengan teknis yang lain Ada dua cara perhitungan kuantitas analit : dengan
· Perbandingan dengan library yang ada mengukur tinggi puncak dan menentukan area puncak
perangkat lunak komputernya. kromatogram.
Mengukur dengan tinggi puncak kromatogram dapat
Kendala yang dihadapi : dilakukan lebih sederhana dan cepat akan tetapi puncak-
· Pemakaian waktu tambat puncak kromatogram yang besar banyak informasi
· Analisis kualitatif pasca kolom kadar yang tidak terdeteksi. Untuk area puncak
· Analisis dengan detector Photodiode array kromatogram ada empat cara yaitu : normalisasi area,
· Analisis dengan teknik terpadu. normalisasi area : normalisasi area dengan faktor
respons detektor, standarisasi dengan standar eksternal
dan penambahan standar internal
Terima kasih