POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

1. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini kami harapkan mampu:
- Menjelaskan Teori Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
- Mengoperasikan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan baik dan benar.
- Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kuantitatif dan kualitatif dengan
menggunakan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

2. ALAT YANG DIGUNAKAN

- Syiringe
- Penyaring Milipone
- Kolom Licosphere C-18
- Perangkat HPLC + Injektor + Pencetak Kromatogram

3. BAHAN YANG DIGUNAKAN

- Cafein 15 ppm
- Metanol

4. DASAR TEORI
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi
cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat
berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu
kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom
kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett
untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner
dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat
atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan
fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi
yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan
teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan kinerja tinggi

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

(HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah
mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena
gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu
pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom
cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan
tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000
p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan
ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini
dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan
yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah
terbukti luas penggunaannya dalam kimia organic
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar
merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut
yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang
dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat
memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel
dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-
industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem
HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis
karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral. Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan
dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase
terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan
pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan
HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis
HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom

dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar
90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai
reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi
karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam
beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik.
Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar
garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase
gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel
bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel

ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase
diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut
yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil.
Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat
diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini
tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel
jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini
dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk
keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan
kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas
atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat
bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010).

Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC adalah :

a. Reservoir pelarut : zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari
senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa tempat pelrut tersebut harus
memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut

b. Pompa : digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan kecepatan dan
tekanan yang tetap

c. Injektor : saat sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak mengganggu
masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat menggunakan syringe.

d. Kolom krmatografi : kolom yang dipakai memiliki panjang 10 – 25 cm dan diameter 4,5 – 5 mm
yang diisi dengan fase stasioner beukuran 5-10 mikrometer dan terbuat dari logam atau
stainlessteel.

e. Detektor : digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk mempunyai

sinsitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati eluen tanpa
mempengaruhi resolusi kromatografi.

Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi;
lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah
untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis
ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan
molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan
senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah
sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC
merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif (Cupritabu, 2010)
Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC
berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak
digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. Prinsip umum kromatografi:

Keterangan :
 Fase gerak
 Fase diam
 Kolom
 Detektor
 Rekorder

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan
metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan
spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang
baik sulit diperoleh (Cupritabu, 2010).
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya
mnyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan
analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti
methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi
tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini
tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol
digunakan sebagai analgesic dan antipiretik (Cu)

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

ANALISA PERCOBAAN

Pada percobaan kali ini,analisis “HPLC” didasarkan pada pengukuran luas atau area
puncak dalam kromatogram.pada percobaan penentuan kadar caffeine dalam sampel dengan
menggunakan metode HPLC, digunakan satu deret standar yang konsentrasinya yaitu 10
ppm. Hplc adalah suatu metode pemisahan dari analit berdasarkan perbedaan interaksi pada
diam dan fase diamnya.sehingga didapatkan waktu retensi yang berbeda-beda antara
komponen yang satu dengan komponen yang lainnya.
Metode yang digunakan pada pengujian ini adalah analisis kromatografi dengan fase
gerak cairan dan fase diam.fase diamnya berupa cairan dan padatan fase gerak yang
digunakan adalah air dan methanol dengan perbandingan 40:60. Air yang digunakan harus
bersih dan tidak ada berupa padatan,bila kandungan tersebut berupa padatan yang kecil-kecil
akan terjadi sumbatan dan susah untuk menghilangkannya.setiap percobaan disuntikan
caffeine dan akan tertera konsentrasinya.setiap penyuntikan caffein terlebih dahulu dilakukan
penghilangan gelembung udara yang ada dalam penyuntikan.
Dalam preparasi larutan standard an sampel digunakan membrane (Poly Tetra Fluro
Ethylene) untuk proses pemurnian larutan satndar maupun yang akan dipisahkan dari
pengotornya.dari data kromatogram larutan standar dengan caffein waktu retensinya 3.94,
sedangkan sampel 1, sampel 2 dan 3 sampel 2 waktu retensinya masing-masing 3.94 dan
3.97. Waktu retensi yang didapat pada larutan standar menjadi acuan dalam menentukan
komponen-komponen yang terdapat dalam sampel.

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

Kesimpulan
- Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.
- Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan
fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar
senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk
degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan
kafein dalam suatu campuran.
- HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak
mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk
mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen
zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan
efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase
diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui
kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal
sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
- Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detector
disebut sebagai waktu retensinya.
- Posisi injector yang ada pada posisi load casas akan menginjeksi sampel.

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

 POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

DAFTAR PUSTAKA

Acun., Sodiyc. 2010. Kromatografi Gas. http://sodiycxacun.blogspot.com. 11 November 2010.

Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit Andi Offset.
Yogyakarta.
Cupritabu, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat dengan
HPLC.http://cuprittrappedonlab.blogspot.com. 11 November 2010.
Khopkar, S.M., 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.
Riyadi, W. 2009. Identifikasi signal kromatogram HPLC.http://wahyuriyadi.blogspot.com. 11
November 2010

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT