A.

Pengertiaan Kromotografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan

perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen -komponen
akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan
menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen
campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan
komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra
Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan
kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis. sistem UPLC terdiri dari sistem
deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray
ionisasi dalam konfigurasi sekuen. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi,
temperatur ekstraksi, waktu ekstraksi yang stabil, dan cara ekstraksi yang optimum. Analisis
UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak
asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0,50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium
asetat. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan
mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan
analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C. chinensis Franch. Sampel juga dianalisis
dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi.

Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine, palmatine dan jatrorrhizine telah
terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua
metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid
dalam C. chinensis Franch. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis
menggunakan metode yang digunakan. Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid
utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi
kualitas dari obat herbal tradisional cina.

Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan
pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4).
lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna
yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah
yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi menurun untuk beberapa tahun sampai digunakan

suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun
1930-an dan permulaan tahun 1940-an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi
lapisan tipis (KLT) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian
diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge
pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan
cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi
gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah
pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada
dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat
membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk
pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi
atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan
Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya
instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk
mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom
dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan
cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran

senyawa. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai
fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit (
kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan
 memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu
yang relative singkat.

HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara
lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Dalam
makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang penggunaan HPLC ( High
Performance Liquid Chromatography).

B. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.

Prinsip kerja kromatografi cair kinerja tinggi adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair
dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang
kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut
yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi
oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada
kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Instrumen
kromatografi cair kinerja tinggi antara lain terdiri dari fase gerak, pompa, kran cuplikan, kolom
dan detektor.

Sistem Peralatan HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
 gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-
partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan
fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan
harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh
ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC
berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-
polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18)
merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-
senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih
pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
7. Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik
detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik

(g/ml) linier
Absorbansi Uv-
vis 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling
Fotometer filter 5 x 10-10 105 sering digunakan, selektif
Spektrofotometer > 2 x 10-10 105 terhadap gugus-gugus dan
spektrometer struktur-struktur yang
photo-diode tidak jenuh.
array
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan
Amperometri 10-12 105 suhu dan kecepatan alir
fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan
adanya kontaminasi
elektroda.
 Pengertian Flourosensi

Emisi cahaya terjadi karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan
keadaan atom tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali keadaan semula
dengan melepaskan energi yang berupa cahaya (deeksitasi). Fluoresensi merupakan proses
perpindahan tingkat energi dari keadaan atom tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan
stabil (ground states). Proses fluoresensi berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan
proses fosforesensi berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.
Fluoresensi spektroskopi menggunakan foton energi yang lebih tinggi untuk merangsang sampel,
yang kemudian akan memancarkan foton energi yang lebih rendah. Teknik ini telah menjadi populer
untuk biokimia dan aplikasi medis, dan dapat digunakan untuk mikroskopi confocal,
fluoresensi mentransfer resonansi energi, dan pencitraan fluoresensi seumur hidup.
Spektroskopi Fluoresensi Atom. Pada metode ini seperti pada spektroskopi absorpsi
atom untuk membentuk partikel-partikel atom diperlukan nyala api. Energi radiasi yang
diserap oleh partikel atom akan dipancarkan kembali ke segala arah sebagai radiasi
fluoresensi dengan panjang gelombang yang karakteristik. Sumber radiasi ditempatkan tegak
lurus terhadap nyala api sehingga hanya radiasi fluoresensiyang dideteksi oleh detektor
setelah melalui monokromator. Intensitas radiasi fluoresensi ini berbanding lurus dengan
konsentrasi unsur.
Fluoresensi adalah jenis tertentu dari luminescence, dicirikan bahwa zat yang mampu
menyerap energi sebagai bagian radiasi elektromagnetik dan kemudian memancarkan energi
itu sebagai radiasi elektromagnetik dari panjang gelombang yang berbeda. Total energi yang
dipancarkan oleh cahaya selalu kurang dari total energi yang diserap dan perbedaan antara
energi tersebut yang hilang sebagai panas. Dalam kebanyakan kasus, panjang gelombang
yang dipancarkan lebih besar, dan karena itu, energi yang lebih rendah daripada yang diserap,
namun, jika radiasi eksitasi adalah intens, maka mungkin saja elektron menyerap dua foton,
dalam penyerapan bifotonic. Panjang gelombang yang dipancarkan lebih pendek dari yang
diserap, namun dalam kedua kasus total energi yang dipancarkan lebih kecil dari total energi
yang diserap. Umumnya zat neon menyerap energi dalam bentuk radiasi elektromagnetik
berbentuk gelombang pendek (P misalnya radiasi gamma, sinar-x, UV, biru muda, dll), dan
kemudian lagi memancarkan gelombang yang lebih panjang, misalnya dalam spektrum
terlihat paling mencolok dari fluoresensi terjadi ketika cahaya yang diserap berada dalam
kisaran ultraviolet dari spektrum tak terlihat oleh mata manusia dan cahaya yang dipancarkan
berada di kawasan yang terlihat.
Mekanisme fluoresensi melibatkan tiga langkah berurutan, masing-masing disebut
penyerapan (1), non-radiasi disipasi (2) dan emisi (3). Siklus penyerapan ini sangat singkat,
lamanya waktu berlalu dalam urutan nanodetik.

Mekanisme fluoresensi juga berkaitan erat dengan proses chemiluminescence. Zat yang
mampu memancarkan cahaya ketika menyala oleh berbagai jenis radiasi yang disebut
fluorophores. Hal ini dimungkinkan untuk mendapatkan berbagai macam warna dengan
fluoresensi, tergantung pada panjang gelombang memancarkan senyawa neon. Dalam
fenomenanya fluoresensi memungkinkan penyerapan energi oleh elektron, dari keadaan dasar
(S0) untuk keadaan tereksitasi (S1), kemudian elektron kembali dalam keadaan dasar disertai
dengan pelepasan kelebihan energi oleh radiasi yang dipancarlan. Dalam seluruh proses
fluoresensi terjadi dalam waktu kurang dari 0,00001 detik sama dengan pendar, tapi dengan
proses yang cepat. Perbedaan sehubungan dengan pendar, yaitu fluoresensi berlangsung
hanya selama stimulus. Fenomena fluoresensi memiliki banyak penggunaan di antaranya
digunakan dalam mineralogi, gemology, sensor kimia (fluoresensi spektroskopi), pigmen dan
pewarna, detektor biologis dan lampu neon. Kita ambil contoh Penggunaan dari fenomena
fluoresensi ini adalah lampu neon, fluoresensi bekerja saat di mana zat putih yang menutupi
kristal dalam memancarkan cahaya ketika arus listrik yang dibuat di dalam tabung.
Penggunaan lainnya adalah mendeteksi tiket palsu, karena hanya dicetak aktual membawa
pewarna fluorescent yang terlihat hanya dengan bantuan sebuah "cahaya hitam".

 Suatu Senyawa Dapat di Ukur Dengan Detektor Flouresensi

Proses fluoresensi dapat terjadi pada partikel dalam suatu medium. Hal tersebut terjadi
akibat respon terhadap cahaya eksitasi dari elemen-elemen penyusunnya (kumpulan-
kumpulan molekul atau atom yang relatif homogen) dengan mengasumsikan bahwa dimensi
partikel sangat tipis sehingga proses absorbsi terhadap cahaya eksitasi tidak mengalami
hambatan atau gangguan. Pada saat cahaya eksitasi datang menuju medium yang berisi
partikel-partikel, cahaya tersebut akan diabsorbsi oleh partikel-partikel sebesar IA dan
sebagian diteruskan (tanpa absorbsi) sebesar IT (persamaan 2.13). Cahaya yang diabsorbsi
selanjutnya dikonversi menjadi emisi cahaya fluoresensi (IF) oleh faktor efisiensi kuantum
ΦF.
Hubungan antara intensitas fluoresensi dan absorbansi suatu partikel akibat eksitasi
dari suatu sumber cahaya dinyatakan dengan menggunakan hukum Beer-Lambert. Intensitas

cahaya eksitasi yang ditransmisikan oleh sejumlah konsentrasi partikel N sebesar IT(λE) pada

luasan medium a dan sepanjang arah rambat cahaya eksitasi.

Fluoresensi merupakan proses perpindahan tingkat energi dari keadaan atom
tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses fluoresensi
berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses fosforesensi berlangung lebih lama,
sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik. Fluoresensi spektroskopi menggunakan foton energi
yang lebih tinggi untuk merangsang sampel, yang kemudian akan memancarkan foton energi yang lebih
rendah. Teknik ini telah menjadi populer untuk biokimia dan aplikasi medis, dan dapat
digunakan untuk mikroskopi confocal, fluoresensi mentransfer resonansi energi, dan
pencitraan fluoresensi seumur hidup.
Menurut diagram Jablonski (Gambar 7.1), energi emisi lebih rendah
dibandingkandengan eksitasi. Ini berarti bahwa emisi fluoresensi yang lebih tinggi terjadi
padapanjang gelombang dari penyerapan (eksitasi). Perbedaan antara eksitasi dan
panjanggelombang emisi dikenal sebagai pergeseran Stoke.
Langkah pertama (1) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh molekul,yang
ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti bahwa sebuahelektron
bergerak dari keadaan dasar singlet S0, ke keadaan singlet tereksitasi S1. I n i diikuti dengan
relaksasi getaran atau konversi internal (2), dimana molekul inimengalami transisi dari
elektronik atas ke yang lebih rendah S1, tanpa radiasiapapun. Akhirnya, emisi terjadi (3),
biasanya 10 - 8 detik setelah eksitasi, ketika kembali elektron kekeadaan dasar lebih stabil, S0
memancarkan cahaya pada panjanggelombang yang sesuaidengan perbedaan energi antara kedua
negara elektronik.Dalam molekul, masing-masing kondisi elektronik memiliki beberapa
kondisibagian getaran terkait. Dalam keadaan dasar, hampir semua molekul menempatitingkat
vibrasi terendah. Dengan eksitasi dengan sinar UV atau terlihat, adalahmungkin untuk
mempromosikan molekul yang tertarik ke salah satu tingkat getaranbeberapa tingkat
tereksitasi secara elektronik yang diberikan. Ini berarti bahwa emisifluoresensi tidak hanya
 terjadi pada satu panjang gelombang tunggal, melainkanmelalui distribusi panjang gelombang
yang sesuai untuk transisi vibrasi beberapasebagai komponen dari transisi elektronik tunggal.
Inilah sebabnya mengapa eksitasidan spektrum emisi diperoleh untuk menggambarkan secara
rinci karakteristik molekul fluoresensi.

 Senyawa Yang Dapat di Deteksi Dengan Detektor Flouresensi

Hanya sedikit ion anorganik yang berpendar, yang paling dikenal adalah ionuranil, UO22+.
Umumnya alanisis fluorometrik melibatkan molekul organik. Ada beberapa senyawa kelat logam
yang berpendar yang memberikan metode yang peka untuk beberapa ion logam. Seringkali kelat
logam diekstraksi dari dalam larutan berair menjadi suatu pelarut organik sebelum
pengukuran, suatu proses dan sekaligus memisahkannya dari ion-ion pengganggu dan
mengkonsentrasikan spesies yang berpendar. Misalnya, banyak terdapat reagensia
flourometrik untuk Aluminium dan Berilium. Logam-logam yang lebih berat seperti Fe2+,
Co2+, Ni2+ dan Cu2+ sebaliknya cenderung mematikan flourosens yang diperagakan oleh banyak
zat pengkelat itusendiri, hadinya logam itu dalam kompleks mendorong dibuangnya energi
yangdiserap secara tak radiantif. Kadang suatu analit yang tidak berpendar dapat diubah
menjadi suatu molekulyang berpendar kuat, dengan suatu reaksi yang cepat dan kuantitatif, yang
denganmuadah digabungkan ke dalam suatu prosedur analitik keseluruhan. Misalnya, hormon
epinefrin (adrenalin) mudah diubah menjadi adrenolutin. Dalam larutan basa,anion folat dari
adrenolutin berpendar dengan kuat (eksitasi 360 nm, pancaran 530 nm). Pasien dengan tumor
tertentu pada kelenjar adrenalin dan juga beberapa penderita tekanan darah tinggi
menunjukkan kadar efinefrina yang meningkat dalamair seninya. Hormon yang terdapat pada kadar
yang sangat rendah dapat dipekatkan dari dalam volume besar air seni dengan suatu prosedur
penukar ion pada suatu pHdimana nitrogen amino diprotonkan untuk membentuk suatu kation
R-NH2-CH2, dielusi dalam sedikit volume dengan ditukar-ganti dengan H+ dan diolah seperti
diatas untuk membentuk flourofor. Beberapa vitamin dapat ditetapkan secara fluorometrik.
Oksidasi lembut tiamina (vitamin B1) oleh Fe(CN)63-, misalnya akan menghasilkan suatu
produk yang disebut tiokrom yang memperagakan fluoresens biru pada kondisi yang tepat.
Jika pancaran pendaran itu diukur terhadap dua porsi sampel, satu diolah dengan ferisianida
dan yang lain tidak, orang dapat mengurangi kontribusi pengganggu non-tiamina yang
berpendar untuk meningkatkan selektivitas. Riboflavin (vitamin B1) dan piridoksin (B6)
merupakan vitamin lain yang dapat ditetapkan oleh fluoresensi. Meskipun kebanyakan asam
 amino tidak berpendar, tetapi mudah bereaksi dengan reagen fluoresamina untuk membentuk
senyawa yang sangat berpendar yangtelah digunakan dalam biokimia untuk mendeteksi kuantitas.
Metode fluoresensi sangat baik untuk menetapkan beberapa hidrokarbon aromatik polisiklik
yang telah dikelompokkan sebagai “polutan prioritas” oleh Jawatan Perlindungan Lingkungan
Amerika Serikat (EPA), yang mengatakan bahwafluoresens memberi deteksi yang sangat
peka terhadap komponen-komponen sampeltertentu dalam kromatografi cairan. Misalnya
pada produk Susu : Produk-produk susu mengandung beberapa fluorophores intrinsik.
Misalnya asamamino aromatik dan asam nukleat, triptofan, tirosin dan fenilalanin dalam
protein, vitamin A dan B2, Nikotinamida adenin dinukleotida (NADH) dan klorofil, dan
berbagai senyawa lainnya yang dapat ditemukan pada konsentrasi rendah atau sangat rendah di produk
makanan.

 Proses Terjadinya Eksitasi Molekul

Molekul zat menyerap energi cahaya yang dipancarkan panjang gelombang ultraviolet,
terlihat (inframerah) wilayah spektrum fluoresensi, sesuai dengan karakteristik spektral dan
intensitas analisis kualitatif dan kuantitatif zat, analisis ini adalah analisis fluoresensi molekul.
1. Proses yang terjadi molekul fluoresensi
Molekul neon terjadi terutama mencakup tiga proses: 1, eksitasi molekul, 2 molekul untuk
mengaktifkan, 3, fluoresensi terjadi.
Termasuk singlet bersemangat dan triplet tereksitasi keadaan tereksitasi, sebagian besar
molekul berisi bahkan jumlah elektron dalam keadaan dasar, pasangan elektron dari atom atau
molekul hadir dalam setiap orbit, berputar dipasangkan dalam arah yang berlawanan, elektron
spin bersih nol: S = ½ (- ½) = 0, multiplisitas M = 2S 1 = 1 (M adalah bilangan kuantum
magnetik), oleh karena itu, molekul anti-(anti-) magnet, itu bisa tingkat tanpa medan magnet
eksternal dan divisi, yang disebut "keadaan singlet." Ketika sepasang molekul keadaan dasar
menyerap radiasi sinar elektron sangat tertarik untuk energi yang lebih tinggi transisi orbital,
biasanya tidak mengubah arah spin, yaitu Ä S = 0, maka masih keadaan tereksitasi singlet,
yaitu, "tunggal (re) bersemangat negara", jika proses transisi elektron, juga disertai dengan
perubahan arah spin, maka akan memiliki dua elektron tidak berpasangan berputar, spin
bersih tidak sama dengan nol, dan sama dengan 1: S = 1/2 1 / 2 = 1 multiplisitas: M = 2S 1 =
3. Yaitu molekul yang dipengaruhi oleh medan magnet menghasilkan membelah energi,
negara ini bersemangat disebut "tiga baris (berat) keadaan tereksitasi "triplet exciton"
daripada "singlet bersemangat negara" energi yang lebih rendah.
Tingkat terluar elektron energi molekul, termasuk S0 (keadaan dasar), dan S1 keadaan
tereksitasi, S2, ....., ..... T1, dan masing-masing mencakup serangkaian tingkat energi
elektronik sangat dekat dengan tingkat getaran. Molekul dalam keadaan tereksitasi tidak
stabil, dalam waktu singkat melalui berbagai saluran dalam kelebihan melepaskan energi
(radiasi atau transisi radiasi) menyatakan Kembali bersemangat, proses yang dikenal sebagai
"de-aktivasi", saluran tersebut adalah: (1) relaksasi getaran, (2) konversi internal, (3)konversi
eksternal, (4) lompatan antar sistem, (5) emisi fluoresensi, (6) emisi berpendar.
Molekul dalam keadaan tereksitasi, saluran yang berbeda melalui ke keadaan dasar, yaitu
terjadinya fluoresensi. Cara yang lebih cepat, yang berarti terjadi istimewa. Jika - begitu
bersemangat molekul proses penonaktifan fluoresensi lebih cepat dibandingkan dengan proses
lainnya, kemungkinan terjadinya fluoresensi tinggi dan kekuatan. Jika begitu cepat proses
penonaktifan molekul fluoresensi lambat dibandingkan dengan proses lainnya, fluoresensi
lemah atau tidak terjadi.

2. Eksitasi spektrum dan spektrum fluoresensi

Fluoresensi cahaya eksitasi dengan monokromator spektral, terus mengubah panjang
gelombang eksitasi, emisi panjang gelombang tetap, penentuan panjang gelombang eksitasi
yang berbeda dari cahaya yang dipancarkan oleh zat solusi fluoresensi intensitas (F), sebagai
F-l mengatakan spektrum eksitasi. Dari spektrum eksitasi dapat ditemukan pada intensitas
fluoresensi yang terkuat eksitasi panjang gelombang lex, pilihan terbesar intensitas fluoresensi
lex dapat diperoleh. Pilih lex sebagai sumber eksitasi, monokromator dengan zat lain
dipancarkan spektroskopi fluoresensi, merekam setiap panjang gelombang F, F-l disebut
spektrum spektroskopi fluoresensi. Panjang gelombang fluoresensi intensitas fluoresensi dari
lem terkuat. lex dan lem umumnya digunakan dalam analisis kuantitatif dari panjang
gelombang yang paling sensitif.

3. Fluoresensi dan Struktur Molekul

 Hanya mereka dengan p-p molekul terkonjugasi ikatan ganda untuk memancarkan fluoresensi
kuat, terkonjugasi besar tingkat p-elektron, semakin besar intensitas fluoresensi (lex dan
pergeseran panjang lem) yang berisi sebagian besar cincin aromatik, heterosiklik senyawa
fluoresensi, dan p-elektron terkonjugasi lagi, F adalah. Cincin Benzena tersubstitusi
menyumbangkan elektron-kelompok, peningkatan konjugasi p-à intensitas fluoresensi
meningkat: as-CH3,-NH2,-OH,-OR, dll (Benzena) menggantikan kelompok penarik elektron,
bahkan ketika intensitas fluoresensi menurun Off: misalnya:,-COOH,-CHO,-NO2,-N = N.
Tinggi atom nomor atom, meningkatkan terjadinya sistem persimpangan intersystem, neon
melemah atau bahkan padam. Seperti: Br, I. Juga fluorescein planar konfigurasi, struktur
memiliki kekakuan yang sangat substansi neon, sedangkan fenolftalein molecular structure
planar mudah untuk mempertahankan, substansi neon tidak.

 .Metode Kerja Kromotografi

1. Material dan Reagen

Tujuh sampel C. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao,
China. Standar dari Berberine Hidroklorida, Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine
Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological
Products of China.

Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch, Swiss). Asetonitril untuk
HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg, PA, Amerika Serikat). Bahan kimia lainnya
seperti metanol, etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai,
China). Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q (Milipore,Bedfore,
MA, Amerika Serikat).

2. Preparasi Sampel

C. Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar. Setelah halus
serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0,3 mm sebelum ekstraksi.

 Ekstraksi Refluks
 Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100
mL. Etanol 80% dengan 0,5 % HCl digunakan sebagai pelarut. Satu gram sampel bubuk
ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat. Suspensi diekstraksi selama
1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan. Ekstraksi diulangi dengan
penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Ekstrak gabungan tersebut
disaring, dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C.
Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0,45
µm.

 Ekstraksi Ultrasonik

Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL

larutan 80% ethanol dengan 0,5% HCl dalam labu alas, dimana ditempatkan pada ultrasonik bath
selama 30 menit. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang
dihasilkan digabung. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter
membran nilon 0,45 µm.

 . Percepatan Ekstrasksi Pelarut

Sebuah sistem ASE 100 (Dionex, Sunnyvale, CA, Amerika Serikat) dilengkapi bejana
baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan. Sekitar 1 gram bubuk C.
Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan
ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel
diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan
rotary evaporator pada suhu 50 C. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring
dengan filter membran nilon 0,45 µm sebelum diinjekkan ke sistem UPLC.

 . Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi

Stok larutan standar berberin hidroklorida, palmatin hidroklorida dan jatrorhisin

hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa
murni dalam 10 mL metanol. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1,29 mg/L Berberin
hidroklorida, 0,45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0,30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida
dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam
10 ml metanol. Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar
menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan. Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh
larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan.

 Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry

Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford, MA, USA).
Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18
(1,7µm;2.1mm×50 mm). Pada 200C dan laju alir 0,2
Fase gerak mengandung pelarut A (0,5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO)
dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B. Sistem UPLC digabungkan
dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters, Milford,
MA,USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray. Sumber elektrospray dijalankan dalam
bentuk ion positif. Potensial kapiler di set pada 3,5kV. Pada analisis rutin, spektrometri
massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk
menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C,Chinensis Franch. C,Chinensis
Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode, cone voltages dan
energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi.
 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass
spectrometry
Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC, sebuah kolom (Alltima
C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0,5%
CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1.0 mL/min. Elusi
dimonitor oleh detector sinar diode. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 µL
dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal.
Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF . spektro ini digunakan untuk
menganalisis alkaloid dalam C ,Chinensis Franch. Software yang digunakan dalam analisis
ini ialah QS Software analysis. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi
alkaloid, mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C, aliran gas 11 L/min, tekanan
gas 50 psi, fragmentor 100 V, potensial kapiler 4000V. Larutan standar (reff) digunakan m/z
121.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias.
 Metode validasi UPLC
 Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi
yang berbeda dalam triplicate. Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model
regresi linier. Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang
diperoleh, dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian
(Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja.
Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine,
palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan
kerja. Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel.
Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam.
Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk
stabilitas system.
Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi. Tiga alkaloid dalam
campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan
antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak.
 DAFTAR PUSTAKA

Watson, David G. 2009. Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan Praktisi
Kimia Farmasi. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Herman, Blaschke G. 1994. Analisis Farmasi. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III.
Departemen Kesehatan RI Jakarta.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV.
Departemen Kesehatan RI Jakarta.

Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy Edisi II. UI Press.

Rucker, G. 1988. Analisa Farmasi Instrumen : Spektroskopi, Kromatografi. UI Press.