H P L C

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

Tujuan :
a) Mempelajari cara kerja alat HPLC
b) Menganalisa sampel secara kualitatif dan kuantitatif dengan alat HPLC

Dasar Teori :
Kromatografi (Chromatography) berasal dari bahasa Yunani. Chroma berarti
warna dan graphein berarti menggambar. Hal ini pertama kali diperkenalkan oleh
seorang ahli botani Rusia Mikhail Tswett. Pada saat itu sekitar permulaan abad 20, Tswett
memisahkan campuran berbentuk cair melalui kolom. Kolom yang digunakan memiliki
spesifikasi sebagai berikut.

a) Diameter kolom antara 1 hingga 5 cm.

b) Panjang kolom antara 50 hingga 500 cm.
c) Laju alir cairan sekitar 0,1 ml permenit.
d) Ukuran butiran padatan pengisi (packing) antara 150-200 mikro.

Melalui kolom tersebut, campuran yang dipisahkan mengalami elusi (elution) yaitu
proses pelarutan dan pemisahan zat terlarut (sampel) dengan penambahan pelarut
segar (fresh solvent). Dengan terjadinya hal tersebut, maka komponen penyusun
campuran akan terpisah satu persatu tergantung gaya interaksinya dengan pelarut segar
dan permukaan butiran padatan pengisi. Komponen yang mudah larut dalam pelarut segar
dan memiliki kepolaran yang sangat berbeda dengan permukaan butiran padatan pengisi
akan terpisah terlebih dahulu. Sebaliknya, komponen yang sukar larut dalam pelarut
segar dan memiliki kepolaran yang sama dengan permukaan butiran padatan pengisi
akan terpisah paling akhir. Klasifikasi kromatografi dapat dilakukan berdasarkan
beberapa kriteria. Jika berdasarkan pada bentuk tempat butiran padat, kromatografi
diklasifikasikan menjadi dua, yaitu Kromatografi kolom dan Kromatografi planar Jika
diklasifikasikan berdasarkan bentuk pembawanya, kromatografi juga dibagi dua, yaitu
:Kromatografi cair (liquid chromatography) dan Kromatografi gas (gas
chromatography)

Dari dua cara klasifikasi tersebut, secara umum terdapat dua hal pokok yang
selalu ada pada kromatografi yaitu adanya fasa diam (stationery fase) dalam hal ini
diwujudkan pada butiran padatan atau packing, dan fasa bergerak (mobile fase) baik
berupa cairan maupun gas pembawa. Selanjutnya, kromatografi kolom yang
menggunakan fase gerak cair dapat diklasifikasikan lagi berdasarkan cara pemisahannya
menjadi empat, yaitu : Kromatografi Partisi, Kromatografi Adsorpsi, Kromatografi
Pertukaran ion, Kromatografi Eksklusi

Jika kembali pada cara dan alat yang digunakan oleh Tswett, maka proses
pemisahan tersebut memerlukan waktu yang sangat lama, mulai beberapa jam hingga
beberapa hari. Untuk mempercepat pemisahan, pernah dilakukan dengan menambah
tekanan dan penghisapan menggunakan pompa vakum. Tetapi cara tersebut dianggap
kurang berhasil karena menyebabkan penurunan mutu data yang diperoleh.

Pada awal tahun 1960, muncul pemikiran baru untuk melakukan pemisahan
dengan menggunakan spesifikasi alat yang relatif lebih kecil, yaitu :

a) Diameter kolom antara 1 hingga 5 mm.

b) Panjang kolom antara 30 hingga 50 cm.
c) Laju alir cairan dapat mencapai 10 ml per menit.
d) Ukuran packing hanya 6 mikron.

Dengan alat dan cara tersebut diperoleh efisiensi pemisahan yang jauh lebih
baik. Waktu yang diperlukan hanya dalam ukuran menit, cairan pembawa yang digunakan
jauh lebih sedikit dan mutu data yang diperoleh jauh lebih baik. Oleh karena itu, alat dan
cara ini disebut High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Pada dasarnya, sebuah
alat HPLC terdiri atas :

 Botol Penampung

Botol penampung biasanya berjumlah empat buah. Masing-masing berisi

pelarut murni sebagai cairan pembawa (fasa gerak). Dari masing-masing botol,
 cairan mengalir ke suatu penampung sebelum membawa analit yang telah
disuntikkan ke dalam kolom. Penampung tersebut berfungsi sebagai wadah
pencampuran jika memang diperlukan.

 Pompa

Pompa yang sering digunakan pada HPLC harus memenuhi kriteria

sebagai berikut :

 Tekanan dapat mencapai 400 bar.

 Laju alir yang dihasilkan konstan dan tidak berfluktuasi.
 Dapat menghasilkan laju alir hingga 10 ml/menit.
 Dapat mereproduksi laju alir secara tepat.
 Tidak bersifat korosif.
 Dengan kriteria seperti itu, maka terdapat tiga jenis pompa yang sering
digunakan, yaitu Reciprocating pump, Displacement pump, Pneumatic pump

Reciprocating pump terdiri dari tangki dan piston yang bergerak maju
mundur dilengkapi dengan beberapa katup. Pompa jenis ini memiliki karakteristik
seperti tersebut di atas. Tetapi, jika hanya satu unit pompa saja yang digunakan,
maka akan terdapat fluktuasi laju alir. Untuk menghindari hal tersebut, maka
minimal dua unit pompa dipasang dan bekerja berlawanan. Jika salah satu sedang
menghisap pelarut, maka yang lain akan mengeluarkannya.

Displacement pump berupa batang berulir dan piston. Jika ulir yang
digerakkan motor berputar, maka akan menggerakkan piston maju atau mundur
sesuai keperluan. Kerugian sistem ini adalah tidak dapat menghasilkan tekanan
setinggi displacement pump.

Pneumatic pump adalah tangki bertekanan yang di dalamnya memiliki

gelembung fleksibel terbuat dari karet. Tekanan di dalam tangki diperoleh dari
gas mampat (pressurised gas).

 Katup

Katup berfungsi untu mengatur komposisi pelarut yang diperlukan. Selain itu
juga berfungsi untuk mengatur laju alir pelarut.

 Kolom

Kolom HPLC pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat dengan
permukaan dalam sangat halus dan berdinding tebal. Kolom yang sering digunakan
biasanya berdiameter dalam 4,6 mm dan panjang 25 cm. Kolom ini diisi packing
berukuran 5 mikron dan memiliki 50.000 plates/meter.

Akhir-akhir ini, terdapat kolom jenis baru yang dikenal dengan kolom
mikro. Kolom ini berdiameter dalam sekitar 1 mm dengan panjang 3 hingga 7,5 mm.
Meskipun ukuran kolom relatif kecil, akan tetapi dengan packing berukuran 3 mikron
maka kolom mikro memiliki 100.000 plates/meter.

 Gerbang suntik

Gerbang suntik pada HPLC didisain sedemikian rupa sehingga mampu

membatasi jumlah analit yang masuk kolom pada volum tertentu misalnya 20
mikroliter. Jika analit yang disuntikkan lebih dari jumlah tersebut, maka sisanya
akan dibuang. Selain itu, gerbang suntik dirancang dengan dua jalur yang dapat
diubah-ubah arahnya dengan memutar tuas. Kedua jalur tesebut adalah Jalur
penyuntikkan dan Jalur memasukkan analit ke kolom

 Detektor

Detektor merupakan alat yang dapat mengidentifikasi senyawa yang keluar dari
kolom. Detektor yang baik harus memiliki kriteria sebagai berikut.

 Memiliki sensitivitas 0,1 pikogram hingga 10 nanogram/detik.

 Mampu memberikan respon linier sesuai jumlah yang terdeteksi.
 Respon tersebut harus cepat dan tidak tergantung laju alir.
 Mudah dioperasikan.
 Dapat mendeteksi berragam senyawa.
 Tidak bersifat destruktif.

Berdasarkan kriteria tersebut, detektor yang sering digunakan adalah :

Spektrofotometer ultra violet, Fluorometri, Spektrofotometer infra merah,
Refraktometer, Konduktometer dan Spektrograf massa

 Data Prosesor

Alat ini berfungsi untuk mengubah sinyal dari detektor menjadi data berupa
angka-angka yang diperlukan misalnya data tentang waktu retensi (Rt), luas kurva,
persentase luas kurva dan sebagainya. Data prosesor dapat berupa integrator atau
komputer.

 Fase Gerak (Mobile Fase)

 Fase gerak yang berfugsi untuk membawa analit melalui kolom dan
mencapai detektor harus memiliki syarat sebagai berikut, antara lain : Kemurnian
tinggi,mudah didapat dan murah, titik didihnya 20 - 50 oC di atas suhu kolom, viskositas
rendah, tidak bereaksi dengan analit dan fase diam, tidak melarutkan fase diam
maupun pelapisnya, sifatnya berbeda dengan analit pada detektor, tidak berbahaya dari
segi kebakaran dan keracunan

Interaksi Fase Gerak dengan Fase Diam

Analisis kromatografi dengan HPLC amat tergantung pada interaksi pelarut dengan
dua unsur lainnya yaitu fase diam dan analit. Gaya interaksi ketiga hal tersebut dapat
dijelaskan melalui Teori Polaritas Relatif. Urutan polaritas setiap gugus fungsional mulai
dari yang paling tinggi hingga paling rendah adalah Hidrokarbon, Eter, Ester, Keton,
Aldehida, Amida, Amina, Alkohol

Polaritas air lebih tinggi dari semua gugus fungsional tersebut.

Sebagai acuan, analisis kromatografi akan berhasil jika polaritas analit hampir sama
dengan polaritas fase diam tetapi sangat berbeda dengan polaritas fase gerak. Hal itu
lebih baik jika dibandingkan dengan polaritas analit yang hampir sama dengan
polaritas fase gerak namun amat berbeda dengan polaritas fase diam karena hal ini
menyebabkan waktu retensi (Rt) sangat pendek. Apabila polaritas analit dan fase diam
terlalu mirip dan berlawanan sekali dengan fase geraknya, maka Rt akan sangat panjang.
Berdasarkan polaritas fase diam dan fase gerak yang digunakan, HPLC digolongkan
menjadi dua, yaitu :Kromatografi Normal dan Kromatografi Fase Terbalik

Kromatografi Normal adalah cara yang paling awal digunakan. Pada metode ini,
fase diam yang digunakan bersifat sangat polar, misalnya silika, alumina dan tri etilin
glikol. Sebaliknya, pelarut yang digunakan bersifat non-polar misalnya heksana dan propil
eter. Akan tetapi, dengan mempertimbangkan jenis pelarut non-polar yang amat
sedikit dibanding yang polar, maka saat ini metode di atas dibalik dengan cara
menggunakan fase diam yang non-polar seperti lapisan heksana sedangkan fase
geraknya menggunakan pelarut polar misalnya air, alkohol, hidokarbon, eter dan
sebagainya. Metode ini lazim disebut Kromatografi Fase Terbalik (Reversed Fased
Chromatography).

Alat :
 Reservoir (wadah
 Pelarut / cairan)
 Pompa
 Sistem injeksi
  sampel
 Kolom
 Detektor
 Komputer
 (Pengolah data)
 Printer

Bahan :
 Air
 Metanol
 Fenol
 Eugenol
 Toluena
 Nitrobenzene

Cara kerja :
A. Persiapan

A.1. Mengisi botol penampung (A) dengan pelarut campuran Methanol : Air (15 : 85)
dan penampung (B) campuran Methanol : Air (85 : 95) sebagai fasa
pembawa(gerak).

A.2. Menghidupkan alat dengan menekan ke bawah tombol on/off pada bagian
belakang sebelah kanan.

A.3. Hidupkan detektor UVIS 200 dengan menekan tombol on/off pada bagian
belakang sebelah kanan dan atur pada panjang gelombang 254 nm, RANGE
(AUFS) pada 0,0005 dan RISE TIME pada 0,1 detik.

A.4. Hidupkan personal komputer dengan program Windows 3.1, kemudian pilih
menu Chromatography, lalu click HPLC , click OK, ketik “lab” pada User Name,
ketik “1” pada password, lalu click OK, click HPLC.

B. Analisis

B.1. Melakukan “purging” untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan membuka tutup
depan HPLC, putar ke kiri (membuka) kran purging, tekan tombol “PURGE” “D”.

B.2. Tunggu sampai gelembung dan fasa pembawa lain keluar, lalu tekan
“PUMP/STOP”. Tutup kembali kran purging.
 B.3. Mengatur laju alir fasa pembawa pada 3 ml/menit dengan menekan “FLOW” “A”
“100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW” “1” “ENTER”

B.4. Menyuntikkan sampel Rutin (min. 20 mikro) pada posisi tuas “INJECT”.

B.5. Atur menu mulai merekam pada monitor, menggerakkan tuas dari INJECT keLOAD,
menekan PUMP dan ENTER (pada PC) secara serentak. Lihat petunjuk program
HPLC

B.6. Mengamati sinyal yang tergambar pada monitor.

B.7. Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel Quercetin dan campuran

seperti pada langkah B.4 - B.6.

B.8. Menentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai.

Hasil dan Pembahasan