MANSE LABORATORY

Jalan Raya Jababeka No.97

Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 1 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

A. TUJUAN
Untuk menentukan metode pemeliharaan HPLC.
B. RUANG LINGKUP
Prosedur ini menjelaskan tentang tatacara pemeliharaan kolom HPLC dengan baik dan benar.
C. ACUAN
Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok: UI.
Fortis Technologies. HPLC Column Care. UK: Fortis Technologies Ltd
General HPLC Column Care
D. TEORI
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah
memisahkan setiap komponen dalam sampel untuk selanjutnya diidentifikasi dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen.
Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom standar mempunyai
diameter dalam antara 4-5 mm. Isi kolom harus berukuran homogel dan stabil secara mekanik.
Panjang kolom sekitar 10-30 meter. Kolom dengan diameter dalam yang kecil dibandingkan dengan
kolom standar pada kondisi isokratik akan menghasilkan waktu analisis yang sama.
Kolom merupakan bagian penting dalam HPLC, karena ikut menentukan keberhasilan analisis.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam memilih kolom yaitu panjang kolom, diameter kolom,
pengisi kolom, fase gerak dan tekanan kolom. Karena kolom merupakan instrument penting HPLC,
kolom HPLC harus dirawat dengan baik dan benar. Pemeliharaan kolom HPLC yang tidak baik akan
menyebabkan kolom akan cepat rusak dan tidak dapat digunakan kembali
E. PROSEDUR
1. Column Installation
1. Bilas kolom HPLC dengan fase geraknya. Pastikan tidak ada udara yang terjebak dalam sistem

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 2 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

2. Hubungkan kolom ke injektor sesuai dengan arah aliran (terletak pada kolom)
3. Atur kecepatan aliran pada 0,1 mL/menit (atau pengaturan terendah) dan tingkatkan menjadi
laju aliran normal setelah 5 menit
4. Hentikan aliran ketika fase gerak sudah dapat terbaca oleh detektor
5. Seimbangkan kolom dengan melewatkan fase gerak sekitar 10-30 dari volume kolom dengan
kecepatan normal.
6. Bagi kolom yang dapat digunakan pada kondisi fase terbalik atau fase normal (yaitu, -CN atau
-NH2), bilas dengan IPA atau THF 20-30 volume kolom sebagai pelarut intermediate ketika
berpindah dari fase terbalik ke fase normal, atau sebaliknya. Hubungkan kolom ke injektor.
2. Equilibration
1. Semua pelarut yang digunakan pada kolom HPLC harus memenuhi standar mutu HPLC.
2. Fase gerak harus difilter dan dibebasgaskan sebelum digunakan.
3. Alirkan pelarut yang akan digunakan melalui sistem sebelum intalasi kolom.
4. Hubungkan kolom untuk menyesuaikan arah aliran.
5. Perlahan sesuaikan laju alir yang diinginkan, pastikan tidak terjadi lonjakan tekanan. Kolom
analitik harus dijaga di bawah 400 bar.
6. Bilas kolom dengan fase gerak dengan volume kolom 20 30.
7. Temperature kolom dijaga < 60C untuk menjaga kualitas kolom yang baik. Kolom yang
digunakan melebihi temperature tersebut akan mempengaruhi kualitas kolom.
8. pH fase gerak dijaga antara 2 8 untuk mengoptimalkan kerja fase gerak. Untuk kolom C18
akan beroperasi pada pH 1 11.
9. Penggunaan dapar organik seperti asam format, ammonium asetat akan menjaga umur
penggunaan kolom dibandingkan dapar anorganik seperti fosfat.

3. Column Testing
1. Lakukan pengetesan kolom dibawah kondisi yang optimum

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 3 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

Kolom : Fortis C18 100x4,6 mm 5 p/n : F18-050505

Fase gerak : 60:40 ACN:H2O
Laju alir : 1.0 ml/menit
Suhu : 25 C
Panjang gelombang : 254 nm
1. Urasil
2. Fenol
3. 4-Etilanilin
4. N,N-Dimetilanilin
5. Naphtalen
2. Perhitungan Efisiensi
Efisiensi kolom dapat diperhitungkan menggunakan persamaan berikut:

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 4 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

3. Perhitungan bentuk Peak:

Bentuk peak kolom dapat diperhitungkan dengan menggunakan persamaan berikut:

4. Storage of Column

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 5 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

1. Kolom yang telah selesai digunakan, kolom harus selalu dicuci.

2. Larutan asam ataupun basa tidak boleh dibiarkan berada dalam kolom.
3. Untuk penyimpanan jangka pendek, yaitu selama malam, simpan kolom dalam eluen yang
digunakan dalam analisis terakhir.
4. Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, bilas kolom
dengan air murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
5. Untuk penyimpanan jangka panjang, simpan kolom dalam pelarut organik tergantung dari tipe
jenis kolom (fase diam).
6. Simpan kolom nonpolar dalam metanol. Acetonitril tidak dianjurkan, karena bisa terurai
membentuk pengotor dalam kolom.
7. Simpan kolom polar dalam heptana atau methanol.
8. Simpan kolom silika dalam heptane.
9. Simpan kolom pada suhu kamar dan bebas vibrasi.
10. Catat pelarut yang digunakan dalam penyimpanan kolom dalam notebook.
5. Column Cleaning
Sebelum memulai prosedur pembersihan, lakukan:
1. Bilas kolom dengan air konsentrasi tinggi untuk membebaskan kolom dari dapar
2. Kolom harus dibilas dengan arah yang berbeda untuk memastikan tidak ada penyumbatan
pada frits
Pencucian Kolom dengan Fase Terbalik/Reversed Phase Wash
Gunakan 20 X volume kolom untuk setiap tahap pencucian.
Tahap pencucian:
1. Cuci kolom dengan Air-Asetonitril (ACN) 95:5 untuk menghilangkan dapar
2. Cuci kolom dengan 100% ACN
3. Cuci kolom dengan Air-ACN 50:50

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 6 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

Pada keadaan tingginya senyawa sampel yang tertahan atau matrik pada kolom maka dapat
ditambahkan tahap injeksi Dimetil Sulfoksida (DMSO) atau Tetra Hidro Furan (THF).
Tahap pencucian:
1.
2.
3.
4.

Cuci kolom dengan Air-ACN 95:5 untuk menghilangkan dapar

Cuci kolom dengan 100% ACN
Injek DMSO atau THF sebanyak 4 x 20 l
Cuci kolom dengan Air-ACN 50:50

Pencucian Kolom dengan Fase Normal/Normal Phase Wash

Gunakan 20 X volume kolom untuk setiap tahap pencucian.
Tahap pencucian:
1.
2.
3.
4.

Cuci kolom dengan THF

Cuci kolom dengan Kloroform
Cuci kolom dengan Metilen Klorida
Cuci kolom dengan Heksan

Pencucian Kolom dengan HILIC/Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Wash

Gunakan 20 X volume kolom untuk setiap tahap pencucian.
Tahap pencucian:
1.
2.
3.
4.

Cuci kolom dengan ACN-Air 95:5 untuk menghilangkan dapar

Cuci kolom dengan ACN-Air 50:50
Cuci kolom dengan Metanol-Air 50:50
Cuci kolom dengan ACN-Air 95:5
Hitung volume kolom (berupa perkiraan kasar) dengan cara:

Vm 0,5Ldc2
Vm

: Volume kolom

: Panjang kolom (cm)

dc

: Diameter dalam dari kolom (cm)

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 7 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

6. Column Regeneration
Penyerapan kotoran yang bersifat ireversible yang berasal dari matriks pada kolom dapat
menyebabkan perubahan terhadap selektivitas dan puncak pemisahan. Oleh karena itu perlu dilakukan
regenerasi kolom dengan menerapkan prosedur berikut.
1. Prosedur regenerasi untuk Kolom Fase Terbalik (C18, C8, C4, C1, C30, CN atau Phenyl)
a. Lepaskan kolom dan sambungkan kembali kolom ke kromatografi dengan aliran melalui
kolom dalam arah terbalik.
b. Bilas kolom dengan air tanpa dapar sebanyak 20 volume kolom
c. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolom
d. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolom
e. Bilas kolom dengan heptan sebanyak 20 volume kolom
f. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolom
g. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolom
h. Sambungkan kembali kolom ke kromatogram dengan arah aliran yang benar.
i. Bilas kolom dengan fase gerak tanpa dapar, dan masukkan kembali dapar.
j. Seimbangkan kolom dengan fase gerak sebanyak 20 sampai 50 volume kolom
k. Suntikkan standar atau sampel untuk melihat apakah kinerja telah pulih.
2. Prosedur regenerasi untuk Kolom Fase Normal (Silica, Diol, Nitro dan Amino)
a. Hubungkan kolom ke kromatogram dengan aliran dalam arah sebaliknya.
b. Bilas kolom dengan heptan sebanyak 20 volume kolom
c. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolom
d. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolom
e. Bilas kolom dengan air sebanyak 20 volume kolom
f. Bilas kolom dengan asetonitril sebanyak 20 volume kolom
g. Bilas kolom dengan isopropanol sebanyak 5 volume kolom
h. Bilas kolom dengan heptan sebanyak 20 volume kolom
i. Sambungkan kembali kolom dalam arah aliran yang tepat.
j. Seimbangkan kolom dengan fase gerak sebanyak 50 volume kolom.
k. Suntikkan standar atau sampel dan lakukan pengevaluasi kinerja.
3. Prosedur regenerasi untuk Kolom Ion Exchange (WCX, SCX, WAX and SAX)
a. Bilas kolom dengan eluen yang sama sebanyak 20 volume kolom tetapi dengan
konsentrasi dapar ganda.
b. Ikuti prossedur regenerasi pada fase terbalik
c. Bilas kolom dengan air sebanyak 20 volume kolom
d. Sesuaikan kolom dengan kondisi yang sesungguhnya
7. Troubleshooting

MANSE LABORATORY
Jalan Raya Jababeka No.97
Cikarang
PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLC

Retensi dan disolusi

Penyebab
Hilangnya fase terikat
Terdapat kontaminasi
Pada fase normal terdapat embun pada fase
gerak
Backpressure Change/increase
Penyebab
Blocked frits
Fase terkontaminasi
Presipitasi dapar karena tingginya
konsentrasi dari organik modifier
Tailing/Split peaks
Penyebab
Kekosongan
Blocked frit
Sampel overload
Terdapat kontaminasi
Sampel sukar larut

No. Dokumen
Revisi
Terbitan
Berlaku
Halaman
Disetujui oleh

: 010/IV/088
: 00
: 22 April 2015
: 22 September 2015
: 8 dari 8
: Sarang, S.Farm, Apt.

Solusi
Ganti kolom dan guard
Bersihkan sesuai dengan ketentuan
Gunakan 2% air dalam fase gerak

Solusi
Membalikan kolom dan bersihkan sesuai
dengan ketentuan atau dengan mengganti
frits dan kolom guard
Membalikan kolom dan bersihkan sesuai
dengan ketentuan
Bilas dengan air (>90%)

Solusi
Ganti kolom atau guard
Ganti kolom
Sampel diencerkan
Bersihkan kolom sesuai dengan ketentuan
Modifikasi pelarut injeksi atau komposisi
fase gerak