Bioteknologi Farmasi

Stem Cell
Anastasia
Cindy Espreancelly S
Jauza Nurrianti
M Wildan Shalli R
Putri Sari

Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell

microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future
direction

OUTLINE :

Pendahuluan : Stem Cell

Multipotent and Pluripotent Stem Cells
Microcarrier Technology
Propagation and Differentiation Human
Pluripotent Stem Cell

PENDAHULUAN : STEM CELL

Stem cell atau sel induk adalah sel yang

mempunyai kemampuan untuk
berdiferensiasi menjadi berbagai macam
sel dan mempunyai kemampuan untuk
meregenerasi dirinya sendiri (self
renewal)

TIPE STEM CELL

pluripotent stem cells (embryonic
stem cells)
induced pluripotent stem cells

tissue stem cells

PERBEDAAN
pluripotent stem cells

tissue stem cells

Kemampuan
berdiferensiasi

Bersifat pluripotent : mampu

berdiferensiasi menjadi
berbagai macam sel dalam
tubuh manusia kecuali sel
yang dibutuhkan untuk
embrio, seperti plasenta

Bersifat multipotent:
hanya
dapat berdiferensiasi
menjadi sel-sel
jaringan dimana sel
ini ditemukan

Peranan di
dalam tubuh

Mengubah embrio menjadi

manusia

Menggantikan sel
yang rusak atau yang
luka

Tempat
ditemukan

embrio

Organ dan jaringanjaringan, seperti

sumsum tulang
belakang, darah,
jaringan adiposa,
otot, sistem saraf,
otak dan kulit.

Multipotent and Pluripotent Stem Cells

PLURIPOTENT STEM CELLS,

hESCs dan hiPSCs
Human embryonic stem cells (hESCs) yang
pertama diperoleh pada tahun 1998 oleh James
Thomson
Dengan menggunakan sisa blastosit beku dari
pasangan yang ingin melakukan fertilisasi in
vitro (IVF)
Blastosit dikultur dari embrio yang mengalami
pembelahan awal, kemudain 14 inner cell
masses (ICM) diisolasi dari blastosis. Dihasilkan
lima baris sel dari isolasi tersebut.(Thomson et
al., 1998).

Contd
Pada tahun 2007, Takahashi dan
Yamanaka menemukan metode baru,
yang disebut induced pluripotent stem
cells (hiPSCs).
Menghasilkan sifat pluripotent yang sama
dengan hESCs
Dengan cara mentransfeksi 4 gen ke
dalam fibroblast manusia (Takahashi et
al., 2007).

PERKEMBANGAN
Pada awalanya, hESCs diperoleh dari
tikus (Thomson et al., 1998).
Karena digunakan untuk terapi sel, maka
dicari alternatif lain (selain hewan), untuk
menghindari potensi pindahnya patogen
ke dalam sel
mTeSR1 hESC PHPL dan StemPRO
hESC SFM adalah media yang paling
cocok untuk mengkultur hESCs

Kemampuan Diferensiasi
Fleksibilitas dari hESCs dan hiPSCs
menjadi beberapa jenis sel dalam tubuh
menjadikan mereka kandidat yang
menarik bagi studi perkembangan biologi.
Diharapkan bahwa sel-sel ini pada
akhirnya dapat menemukan aplikasi
dalam terapi sel.

 Biasanya, diferensiasi in vitro hESCs menjadi tiga

lapisan germ membutuhkan terbentuknya embryoid
bodies (EBs), di mana sel agregat berada dalam
suspensi.
EBs dapat berdiferensiasi menjadi endoderm primitif,
endoderm definitif, mesoderm, ektoderm, dan
trophectoderma.
Sampai saat ini, neuron, glia, sel endotel, kardiomiosit,
keratinosit, sel-sel mirip hepatosit, prekursor
hematopoietik, sel osteogenik, sel yang memproduksi
insulin, jaringan prostat, sel lemak dan melanosit telah
didiferensiasi dari hESC

 hESCs telah berdiferensiasi menjadi 80% sel

endoderm definitif dalam serum rendah dan
Activin A.
Sel lebih matang dari organ endodermal yang
dihasilkan dari sel-sel endoderm definitif ini
setelah transplantasi dibawah kapsul ginjal.
Agregat sel endodermal mengekspresikan
berbagai gen penanda, seperti HNF6, FOXA2
dan PDX1 yang menunjukkan bahwa mereka
berasal dari endoderm pankreas.

Potensi Aplikasi dan Uji Klinis

Saat ini, hanya sedikit terapi pada
manusia yang melibatkan hESC
dibandingkan dengan MSC.
Hal ini disebabkan oleh karena
kekhawatiran tentang tumorigensitas selsel ini.

Cedera Tulang Belakang

Delapan sampai sepuluh pasien dengan cedera tulang
belakang yang parah direkrut dalam fase 1 percobaan,
untuk menguji keamanan dari sel progenitor
oligodendrocyte (OPC).
Dalam treatment ini, koktail faktor pertumbuhan
digunakan untuk menginduksi hESCs ke OPC sebelum
mereka disuntikkan ke sumsum tulang belakang yang
mengalami cedera.
Oligodendrocytes berperan dalam mendukung sel saraf
untuk mengembalikan konduksi saraf.

Cond
Uji praklinik sebelumnya dilakukan pada tikus
dewasa menunjukkan bahwa hESC-derived
OPC yang ditransplantasikan meningkatkan
remyelination dan mempromosikan peningkatan
fungsi motorik.
Tujuan dari uji klinis fase 1 adalah untuk
meningkatkan perbaikan isolasi myelin di sekitar
sel-sel saraf dan dengan demikian membangun
kembali kemampuan sumsum tulang belakang
untuk mengirimkan sinyal.

Transplantasi Retinal pigment

epithelial (RPE)
Sel-sel RPE adalah turunan dari neuroectoderm
yang sangat penting untuk kelangsungan hidup
fotoreseptor.
Dalam age-related macular degeneration (AMD),
sel-sel RPE berdegenerasi dan tidak dapat
diganti.
Studi menggunakan model hewan telah
menunjukkan bahwa sel-sel RPE dapat diganti
dengan transplantasi sel donor RPE.
hESC baru-baru ini terbukti menjadi sumber
yang sangat baik untuk menghasilkan sel-sel
RPE.

Cond
Sel-sel hESC-derived RPE ini telah
menunjukkan profil ekspresi gen yang
menyerupai RPE manusia.
Tiga studi sebelumnya telah memanfaatkan
protokol yang berbeda pada mouse sel embrio
stem (mESC) dan hESC untuk membentuk selsel RPE sebelum transplantasi dan tidak
menemukan bukti adanya tumor, sehingga
menunjukkan potensi dalam mengobati AMD.

Models of disease dan drug

screening
hiPSC dapat dihasilkan dari sampel pasien dari berbagai
macam penyakit, hiPSC berpotensi untuk digunakan
dalam banyak model penyakit.
Misalnya, hiPSCs dapat menjadi contoh yang
bermanfaat untuk mempelajari perkembangan pasien
dengan penyakit sporadis, Parkinson, Alzheimer,
juvenile-onset, DM tipe I, dan Duchenne jenis distrofi
otot.
hiPSC juga dapat digunakan untuk skrining obat untuk
cardiotoxicity untuk mengurangi attrition rate dari
perkembangan obat.

Microcarrier Technology

Microcarrier (MC) Teknology

Dibutuhkan suatu teknologi untuk
menghasilkan sel dalam jumlah besar
untuk terapi klinik.
Oleh sebab itu, perlu dipelajari Teknologi
Mikrokarier

Culturing of anchorage dependent

cells
on
MC

Kultur Teknologi Mikrokarier ini, sel di

propagasi di permukaan dari suspensi
partikel padat di medium pertumbuhan
dengan agitasi lambat

Sel akan terikat dan tumbuh di permukaan

mikrokarier

Advantages of the MC culturing

systems

Sistem Mikrokarier merupakan operasi

unit dimana kedua monolayer dari kultur
suspensi dibawa bersamaan

Ada beberapa keuntungan dari sistem ini

 Permukaan yang tinggi terhadap rasio

volume dapat ditingkatkan dengan mudah
dengan mengganti konsentrasi
mikrokarier
Pengadukan Suspensi Mikrokarier yang
homogen dapat memonitor dan
mengontrol variasi paramater lingkungan

 Kultur Mikrokarier dapat di scale up

dengan mudah di stainless steel
konvensional
Mikrokarier dapat digunakan untuk
propagasi sel di kultur 3 dimensi

General requirements and

properties
of
MCs

Permukaan Mikrokarier
Bentuk dan Ukuran
Transparan dan tahan panas

Commercial MCs

 Variasi yang luas dari Mikrokarier tersedia

secara komersial, memberikan peneliti
keuntungan dalam memilih mikrokarier
Mikrokarier komersil ini didesain sesuai
dengan kebutuhan propagasi untuk
produksi vaksin dan biofarmasetik

Propagation and Differentiation Human

Pluripotent Stem Cell

Scaling up MC culture for hPSC

expansion
Beberapa penelitian telah menunjukkan kemungkinan
meningkatkan ekspansi hESC dalam suspensi dengan
menggunakan termos pemintal sederhana (50-150 ml)
tanpa kontrol pH dan oksigen
Serra et al. (2010) menggabungkan teknologi MC dalam
bioreaktor dengan kontrol otomatis untuk menunjukkan
skalabilitas dan standarisasi platform MC untuk ekspansi
hESC

 Lalu dihasilkanlah 2.17 106 sel/ml dalam 11 hari

dengan kepadatan pembenihan 1,5 105 sel / ml,
mencapai ekspansi 15 kali lipat
Parameter kunci yang perlu diselidiki untuk
pengembangan skala besar sistem hESC MC yang
efisien yaitu prosedur pembenihan dan transfer sel,
oksigen terlarut, kontrol pH dan efek agitasi

Prosedur Pembenihan
Secara konvensional, sel adherent dikultur pada
termos kultur jaringan yang dipisahkan ke dalam sel
tunggal enzimatis sebelum dibenihkan ke MC untuk
menghasilkan pemerataan sel di MC
Upaya awal kultur hESCs di MCs menunjukkan bahwa
adaptasi hESCs ke sel tunggal merupakan langkah
penting untuk inisiasi kultur hESCs MC.

 Sel tunggal memiliki kelangsungan hidup yang lebih baik

dibandingkan dengan agregat perbenihan yang
dihasilkan dari treatment kolagenase.
Namun, kemudian diketahui kalau perbenihan segumpal
hPSC juga dapat memberikan hasil sel yang serupa.

 Untuk mendapatkan pembenihan segumpal sel 2D

hPSC untuk inisiasi ke kultur MC secara konsisten, suatu
studi menggunakan sel scrapper (EZ passage tool, life
technologies) yang akan menghasilkan gumpalan sel
yang seragam.
Pada kondisi yang statis, agregat sel MC ini akan
meluas dengan melekat ke dekat MC atau agregat sel
MC. Berikutnya dapat dilakukan dengan hanya
menambahkan sebagian kecil MCs yang dilapisi dengan
sel untuk menjadi MC yang baru.
Jadi, pembenihan sel tunggal tidak terlalu penting untuk
menyebarkan sel-sel pada MCs melainkan penting untuk
menghasilkan agregat sel-MC yang seragam.

Oksigen Terlarut
Oksigen merupakan salah satu parameter yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan hESC dan pluripotency,
namun terdapat laporan yang bertentangan mengenai
level oksigen optimal yang dibutuhkan hESCs.
Ada laporan yang menunjukkan kondisi hypoxic lebih
disukasi untuk pertumbuhan hESCs dan pemeliharaan in
vitro pluripotency.

 Sedangkan, Serra et al. (2010) menunjukkan bahwa

kontrol oksigen terlarut pada 30% saturasi udara
menghasilkan pertumbuhan sel yang lebih baik
dibandingkan dengan 5% saturasi udara (kondisi
hypoxic) dalam cotrolled bioreactor
Lalu disimpulkan bahwa perbedaan level oksigen tidak
memiliki efek signifikan pada tingkat ekspresi pluripotent
marker SSEA 4. Sehingga harus dilakukan penelitian
lebih lanjut untuk menyelesaikan kontroversi tersebut.

Agitasi
Lock and Tzanakakis (2009) menunjukkan bahwa
penyebaran hESCs pada MC dalam labu spinner sensitif
dengan tingkat kecepatan agitasi.
Kecepatan pengadukan tinggi (80 rpm) menghasilkan
hasil sel yang lebih rendah dan meningkatkan waktu 2
kali lipat jika dibandingkan dengan kecepatan agitasi
rendah (45 rpm).
Studi lain menyebutkan bahwa hESC lines berbeda yang
disebarkan di MC dapat memberikan respon berbeda
terhadap agitasi.

 Pada kondisi agitasi yang sama, HES-3 menunjukkan

penurunan ekspresi pluripotent marker, sedangkan tidak
ada perubahan signifikan yang diamati pada HES-2
(Leung et al., 2010)
Tidak terjadi peningkatan yang teramati ketika dilakukan
penambahan 5 jenis polimer pelindung sel yang berbeda
(pluronic-F68, dekstran, metilselulosa, polietilen glikol,
dan asam hyaluronic) ke dalam kultur HES-3 MC yang
telah teragitasi

 Sifat dari lapisan MC juga dapat mempengaruhi

sensitivitas hESC terhadap agitasi.
HES-3 yang disebarkan dalam agitated spinner flask
yang dilapisi MC dengan lapisan laminin menunjukkan
penurunan yang signifikan dalam ekspresi pluripotent
marker bila dibandingkan dengan yang dilapisi oleh
Matrigel.
Bardy et al. (2013) menunjukkan bahwa hiPSc (IMR90)
yang disebarkan pada MC memperlihatkan peningkatan
ekspresi pluripotent marker pada kondisi agitasi ketika
medium pertukaran (80% dari total volume kultur)
diberikan 2 kali dan bukan sekali per hari.

 Hal ini menunjukkan bahwa kondisi metabolik pada

kultur agitasi dapat berkontribusi menghilangkan
pluripotency (tingginya level laktat atau pH rendah yang
dihasilkan dalam kultur dengan densitas tinggi).
Kesimpulannya, sensitivitas hPSCs pada agitasi dapat
adikaitkan tidak hanya oleh kecepatan agitasi tapi juga
oleh hPSC lines, lingkungan kultur dan lapisan pada MC.

Cell Harvesting
Pemilihan prosedur dan kondisi yang sesuai untuk
memanen sel dari MCs sangat penting agar proses
sukses.
Enzim proteolitik rekombinan Tryple Express, secara
rutin digunakan untuk melepaskan hESCs dari MC lalu
diikuti dengan penyaringan menggunakan saringan 40
m untuk menghilangkan MCs (Oh et al., 2009).
Studi ini menunjukkan bahwa sel-sel panen tersebut
dapat dibudidayakan kemudian ke MCs yang segar dan
menghasilkan sel yang sama dengan yang dibenihkan
dari agregat sel MC yang dipisahkan secara mekanis.

 Lock dan Tzanakakis (2009) memanen sel endoderm

definitif dari MCs menggunakan kolagenase.
Lecina et al. (2010) mengembangkan metode panen
yang berbeda untuk cardiomyocytes dari MCs yang
menggunakan 2 enzim (kolagenase IV dan trypsin)
berturut-turut.
Metode dan kondisi panen sel bergantung pada jenis sel
dan sifat MC.

Metode-metode ini dirancang untuk skala kecil dan tidak dapat

secara langsung untuk proses scale up.

Sistem yang dikembangkan untuk panen adherent cell lines lain

dalam skala besar dapat disesuaikan dengan hPSCs.

Sebagai contoh, Lindskog et al. (1987) memperlihatkan

penggunaan dextranase untuk menghilangkan kultur sel pada MC
dengan basis dextran.

Billig et al. (1983) memperlihatkan bahwa pemisahan sel MC dapat

dilakukan dengan cara diferensial sentrifugasi dengan FicollPaque.

 Rho-kinase inhibitor Y27632, diketahui efektif dalam

mencegah pemisahan hPSC ketika apoptosis
Selain itu, karena sel panen merupakan produk yang
utama, partikel-partikel sisa lainnya dari MC harus
dihilangkan.
Perkembangan terakhir pada MC termo-sensitif
memungkinkan adanya pelepasan sel melalui
perubahan temperatur tanpa adanya penggunaan enzim
proteolitik. Misalnya yang telah banyak dipelajari yaitu
polimer termo-sensitif seperti poli-N-isopropylacrylamide
(pNIPAAm). Mengkultur sel pada pNIPAAm ditambah
MCs (misal Cytodex 3, polystyrene, alginat, dan
polyhydroxy etyl methacrylate) telah terbukti terjadi
pelepasan sel yang efisien dengan menurunkan
temperatur kultur dari 37C menjadi dibawah 30C

Differentiation
Sel-sel progenitor hESCs terdiferensiasi atau intermediet
diperlukan untuk terapi sel.
Oleh karena itu akan sangat ideal untuk
mengkombinasikan ekspansi dan diferensiasi hESCs
pada MC dalam bioreaktor.
Namun, tantangannya adalah dalam membangun
sebuah platform berbasis MC yang terintegrasi harus
mempertimbangkan banyak protokol berbeda yang
membutuhkan beberapa manipulasi fisik termasuk
replating, co-culturing, seleksi sel atau passaging.

 Beberapa kelompok peneliti cukup sukses dalam usaha

tersebut, misalnya Lock dan Tzanakakis (2009)
memperlihatkan generasi FOXA2 dan SOX17 positif
endoderm definitif setelah ekspansi hESC pada MCs.
Efisiensi pada MC secara signifikan lebih tinggi (84,2%)
jika dibandingkan dengan kultur 2D yang menjadi 63,2%.

 Diferensiasi cardiomyocyte merupakan kondisi dimana

MC bermain peran penting dalam memenuhi kebutuhan
untuk menghasilkan jumlah besar sel yang diperlukan
untuk terapi infrak jantung.
Lecina et al. (2010) menskrining 2 MCs yang berbeda
dan menemukan protamine yang dilapisi TSKge1 Tresyl5PW (Tosoh Bioscience) MC ( 10 mm) merupakan
MCs yang paling optimal untuk diferensiasi
cardiomyocite.

 Efisiensinya 2-3 kali lipat lebih tinggi dalam kultur MC

dengan 0,28-0,62 cardiomyocyte yang dihasilkan per
hESC dibandingkan dengan 0,13-0,22 melalui
pembentukan badan embryoid.
Bardy et al. (2013) juga telah memberikan kemajuan
dalam diferensiasi saraf dengan MCs, yaitu dengan
mengkombinasikan 7 hari ekspansi hESC dengan
pembenihan 2 x 105 sel/ml dan 16 hari diferensiasi saraf
pada MCs. Lebih dari 300 PSA-NCAM positif sel saraf
progenitor (NPC) per hESC telah dihasilkan.

Kesimpulan
Untuk membuat platform MC yang layak, ada kebutuhan
untuk mengoptimalkan sifat MCs (misalnya penyalut,
ukuran, dan bahan).
Selain itu, karena ada kebutuhan untuk mempertahankan
pluripotency pada fase ekspansi dan mendapatkan
diferensiasi yang efisien pada tahap berikutnya, MCs dapat
juga direkayasa dengan memasukkan sifat inovatif lain
seperti enkapsulasi faktor pertumbuhan dan matriks bioaktif, yang dapat memfasilitasi ekspansi hPSC, diferensiasi
dan juga transplantasi in vivo.

Di samping masalah yang berkaitan dengan struktur MC dan

komposisinya, ada kebutuhan untuk mengembangkan sistem skala
besar yang khusus karena platform hPSC MC tidak mudah
disesuaikan dengan bioreaktor konvensional karena adanya efek
shear stress.
Selain itu juga harga yang terjangkau dari media yang xeno-free,
regimen makan yang efisien, pengembangan ekspansi sel
terintegrasi dan proses diferensiasi, serta seleksi dari sel-sel yang
diinginkan masih tetap diperlukan.
Platform MC klasik yang dikembangkan untuk produksi biologi sel
adherent kurang optimal pada stem cells. Diperlukan modifikasi
teknologi MC dan proses terkait yang harus disesuaikan dengan
kebutuhan stem cells dan aplikasi klinis yang akan digunakan
nantinya.

Referensi
Allen KC, Shaul R, Steve KWO. Application of human
mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier
cultures in cellular therapy: Achievements and future
direction. Biotechnology Advances. 2013;31:1032-1046.