PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL DENGAN

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(HPLC)

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA INSTRUMEN

Tanggal Praktikum : 12 November 2010

Disusun Oleh :
Kelompok 7
Risa Nurkomarasari (0800530)
Ersan Yudhapratama (0801357)
Redi Ahmad Fauzi (0805450)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIDKAN INDONESIA
2010
 Tanggal Praktikum : 12 November 2010

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL DENGAN

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(HPLC)

A. Tujuan
1. Mahasiswa memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kuantitatif.
2. Mahasiswa dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat
mengikuti manual pengoperasian HPLC.
3. Mahasiswa dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dalam sampel.

B. Tinjauan Pustaka
Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggrisnya
dikenal dengan sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLC
ini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,
pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan
teknik kurva kalibrasi.
(Tim Kimia Analitik Instrumen. 2010:11)
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem
pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung
oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor
yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan
secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran. KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang
antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum
KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-
senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan
untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino,
asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar
senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.
Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada
pemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau
HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic teknik
HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai
berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti polimer.
Kelebihan KCKT antara lain:
 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
 Resolusinya baik
 Mudah melaksanakannya
 Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
 Dapat digunakan bermacam-macam detektor
 Kolom dapat digunakan kembali
 Mudah melakukan rekoveri cuplikan
 Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan
reprodusibilitasnya lebih baik
 Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
 Waktu analisis umumnya singkat
 Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar
 Ideal untuk molekul besar dan ion
(Putra, Effendy De Lux. 2004 :8)
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika
KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah
jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa
gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa
 gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen
campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa
diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari
kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa
diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar
dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram gas. (Hendayana,
Sumar.2006:69)

Gambar B.1 Diagram kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC

Gambar B.2 Skema Alat HPLC

Konsentrasi Solut dalam setiap fasa dinyatakan sebagai koefisien partisi, K.
Cs dan Cm adalah konsentrasi Solut dalam fasa diam dan fasa gerak.
 𝐶𝑠
𝐾=
𝐶𝑚
Sebagai alternative, distribusi Solut-solut di antara dua fasa-fasa tersebut
dinyatakan dengan satuan massa atau waktu keluarnya solut atau volume fasa gerak:
𝑔𝑠
𝐾′ =
𝑔𝑚
(𝑡𝑅 − 𝑡𝑜) (𝑉𝑟 − 𝑉𝑜)
𝐾′ = =
𝑡𝑜 𝑉𝑜
K‟ adalah factor kapasitas, gs dan gm adalah masssa Solut dlam fasa diam
dan fasa gerak dan Tr dan t 0 adalah waktu yang diperlukan untuk elusi solut yang
berikatan dan solut yang tidak berikatan dengan fasa diam. Perkalian waktu-waktu
ini dengan kecepatan alir fasa gerak menghasilkan volume retensi, Vr dan volume
hampa Vo. Walaupun K‟ dan K merupakan kuantitas yang berbeda, tetapi keduanya
berhubungan secara linier.
K‟=KΦ
Ketika senyawa-senyawa dipisahkan dalam kolom maka masing-masing
senyawa menyebar dan menjadi encer. Peristiwa ini dikenal dengan istilah “band
broadening” yang terlihat dari puncak yang melebar. Diffusi Eddy merupakan salah
satu penyebab pelebaran peak. Penyebab kedua berasal dari transfer massa, Solut
selalu berpindah-pindah di antara fasa gerak dan fasa diam.

Gambar B.3 Diffusi Eddy

Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plat
teori. Penerapannya pada kromatografi, jumlah teori plat, N, untuk kolom
ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi. Suatu persamaan yang analog dengan
persamaan Van Deemter dari kromatografi gas telah dikembangkan untuk HPLC.
Persamaan ini dikenal sebagai persamaan knox, yang menyatakan pengaruh-
pengaruh tiap proses “band broadening” terhadap efisiensi.
Resolusi pada HPLC dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivitas(a),
dan retensi (k‟). α adalah selektivitas, k‟1 dan k‟2 adalah masing0masing factor
kapasitas senyawa 1 dan senyawa 2.
𝑘′2
𝛼=
𝑘′1
Jenis retensi Solut merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahan
senyawa bergantug pada jenis dan kekuatan interaksi Solut dengan fasa diam.
Mekanisme retensi dapat dikelompokan menjadi lima, yaitu :
a. Kromatografi adsorpsi
Kromatografi ini sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang
agak polar. Kromatografi yang menggunakan fasa gerak nonpolar dan fasa diam
polar biasanya HPLC fasa normal. Partikel-partikel silika atau alumina
digunakan sebagai adsorben. Untuk mengontrol retensi solut, biasanya
ditambahkan sedikit senyawa polar kepada fasa gerak sebagai modifier.
Modifier bersaing dengan molekul-molekul solut untuk merebut tempat
adsorpsi.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi merupakan kromatografi fasa terbalik dimana fasa
gerak lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa geraknya harus dijenuhkan
dengan zat cair fasa diam untuk mengurangi erosi lapisan fasa diam. Pada
kromatografi ini terdapat keterbatasan selektivitas sehingga ketidak campuran
kedua fasa. Fasa gerak dan fasa diam beberapa senyawa sangat kuat atau tidak
tertahan sama sekali pada fasa diam.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi ini adalah krimatgrafi yang sering digunakan, kromatografi
fasa terikat memiliki persamaan dengan kromatografi partisi. Pada kromatografi
ini, adsorben fasa terikat terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara
kimia dengan rantai alkil. Fasa terikat merupakan fasa yang stabil. Oleh karena
itu, kolom akan bertahan dan keterulangan waktu retensi yang baik.
d. Kromatografi penukar ion
Karakteristik fasa gerak dalam kromatografi penukaran ion seperti yang
diperlukan oleh jenis kromatografi lain. Fasa gerak harus melarutkan cupllikan,
mempunyai kekuatan pelarut yang memberikan waktu retansi yang cocok,
 berinteraksi dengan solut sehingga memberikan harga selektivitas yang tepat.
Fasa gerak dalam kromatografi penukaran ion adalah larutan dalam air dapat
mengandung sedikit metanol atau pelarut organik lain ynag bercampur dengan
air. Pelarut ini juga mengandung senyawa-senyawa ionisasi dalam bentuk
buffer. Kekuatan pelarut dan selektivitas ditentukan oleh jenis dan konsentrasi
bahan-bahan tambahan ini. Umunya, ion-ion dari fasa gerak bersaing dengan ion
analit untuk memperebutkan tempat paking panukaran ion. Fasa diam dalam
kromatografi penukaran ion dapat berupa penukaran ion asam sulfonat untuk
kation atau penukar ion amin untuk anion.
e. Kromatografi eksklusi ukuran
Ukuran molekul merupakan criteria utama dalam pemisahan ini.
Pemisahan terjadi karena Solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori
material paking kolom.Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-
pori akan melewati kolom secara cepat, dan molekul kecil menempati volume
pori dan tertahan lebih lama.
(Hendayana, Sumar.2006:71-77)
Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai berikut :
1. Fasa gerak
Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak
selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor,
juga dapat berinteraksi dengan solut-solut.
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi
beberapa persyaratan berikut :
1). Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2). Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
3). Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom.
Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45
µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran
sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu
base line.
 4). Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak
beracun.
5). Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centi
Poise).
6). Sesuai dengan detektor.
Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis
dalam keberhasilan pemisahan. Seyangnya, teori interaksi fasa gerak dengan
sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih
sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan atas
eksperimen trial-and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut hingga
diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak yang baik
memberikan faktor kapasitas k‟ pada rentang yang seesuai. Untuk cuplikan
dengan 2-3 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang memberikan k‟ antara
2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen, waktu cukup untuk pemisahan
semua komponen. Biasanya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapat
ditemukan untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok. Pemilihan pelarut-
pelarut juga bergantung pada faktor selektifitas (α) untuk komponen cuplikan.
Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut,
karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak
noise sehingga data tidak dapat digunakan.
Tabel 1. Properties of HPLC mobile phase

(Harvey, David. 2000 : 581)

2. Pompa
 Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui
kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC
harus memenuhi persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi.
2. Kelluara bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.
4. Bahan tahan korosi.
Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan
kerugian yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.

Gambar B.4 Pompa

Pompa reciprocating
Jenis pompa ini sekarang paling banyak dipakai. Popa ini terdiri dari
ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-
maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak
langsung dengan pelarut.
Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut
masuk, sebaliknya ketika piston maju bola bawah menutup saluran pelarut dan
pelarut yang telah berada diruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
Gerakan piston mundur dan maju terjadi secara terus menerus sehingga
memeberikan aliran eluen konstan. Pompa ini menghasilkan pulsa yang dapat
mengganggu base-line kromatogram, karena itu dipasang peredam pulsa untuk
menghilangkan gangguan base-line sedangkan keuntungan pompa ini adalah
memiliki volume internal yang kecil. Untu mengurangi bond broadening. Selain
 itu, pompa ini menghasilkan tekanan tinggi, kecepatan alir konstan yang tidak
brgantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga
menghasilkan aliran yang cenderung tidakbergantung tekanan balik klom dan
visikositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi
pompa ini keterbatasan kapasitas pelarit dan tidak mudah untu mealkukan
pergantian pelarut.

Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa
jenis murah dan bebeas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasab kapasitas
dan tekanan yang dihasilkan serta kecepatan alir bergantung pada viskositas
pelarut dan tekanan balik kolom.
3. Pemasukan cuplikan
Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan
band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem
HPLC melalui injeksi srynge, injeksi “stop-flow”, dan kran cuplikan.

Gambar B.5 Syringe

Injeksi syringe
Alat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkan
cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan
untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi
keterulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih
jelek.S
 Injeksi ‘stop-flow’
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran
pelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan
kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
Kran cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak
digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua
langkah :
1. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi
“load”, cuplikan masih berada dalam loop.
2. Kran diputar untuk mengubah cuplikan “load” menjadi posisi “injeksi”
dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-
ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µL. Dengan
sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan pada
tekanan 7000 psi denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan
volume 0,5 hingga 5µL.

Gambar B.6 Tipe injector katup putaran

4. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga
yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat
teradinya pemisahan camppuran menjadi komonen-komponennya. Bergantung
keperluannya koom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk
keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada
tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector.
Selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom).
Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung
keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion.
Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenis
terikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yang
dikenal dengan reaksi silanisasi.
Fasa Diam
Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan pada
material kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 . fasa diam
mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasa
diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa
diam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane
dengan bentukumu Si (CH3)2 RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang
tersubstitusi.

Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus –SiOH, silica
sering direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat
organosilane‟s gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasa
diam akan polar. Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-
C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karena
fasa diam polar, fasa bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar.
Kombinasi dari fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut kromatografi
fasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasa
diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa diam non-polar paling umum
menggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C8) atau n-
octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon.
 Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelum
sisem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter
4,6 mm dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari
ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu
untuk menyaring kotoran yang terbawa dalamfasa diam dan untuk menjenuhkan
fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran
pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat
dihindarkan.
5. Detektor
Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian
detektor harus memenuhi persyaratan berikut :
1. Cukup sensitif
2. Stabilitas dan ketrulangan tiggi
3. Respon linear terhadap solut
4. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir
5. Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan
6. Tidak merusak cuplikan.
Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis detektor yaitu
detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan
adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa
sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang brsifat
umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan.
Tabel 2 Karakteristik detector HPLC
Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Dasar Pendeteksian Jenis
Sensitifitas kecepatan alir ? suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 °C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% °C
Spektometri massa Umum 10-10 Tidak Tidak ada
Elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5 % °C
 Detektor UV
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa
organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga
panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis
cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV
yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organik
menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.

Gambar B.7 Diagram detector UV

Detektor elektrokomia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik dan
poligrafi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi
solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun
anorganik.
(Hendayana, Sumar.2006:83-94)
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern
kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-
macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi
populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa
dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan,
terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada
detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer,
detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.
(Putra, Effendy De Lux. 2004 :6)
6. Rekorder
 Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan
puncak (kromatogram).
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-
puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

Gambar B.7 Beberapa Contoh Kromatogram

Fungsi dari kromatogram antara lain:
1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang
sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif
Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan
dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan
kinerja kolom (kapasitas „k‟, selektifitas „α‟, jumlah pelat teoritis „N‟, jarak
setara dengan pelat teoritis „HETP‟ dan resolusi „R‟).
Penerapan kromatografi cairan kinerja tinggi dapat dilakukan dengan dua
mode oprasional, yaitu :
 Mode isokratik
Mode isokratik serupa dengan mode isotermal dalam kromatografi gas,
hanya dalam HPLC komposisi fasa geraknya yang sama selama pengukuran
berlangsung. Tidak perlu mengatur komposisi campuran fasa gerak.
 Mode gradien
Komposisi fasa geraknya divariasikan selama pengukuran berlangsung.
Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama
suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah
memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di
dalam kolo.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien
dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel berikut ini menunjukkan
kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis
gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Tabel 3. Mode Kompatibilitas dengan Gradien

(Putra, Effendy De Lux. 2004 :7)

 Parasetamol
Struktur parasetamol :
 Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar, dan gugus
kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.
Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC
menggunakan kolom non polar seperti C-18 dan fasa gerak agak polar seperti
methanol/air.
(Tim Kimia Analitik Instrumen. 2010:11)
C. Alat dan Bahan Praktikum
1. Alat
 Perangkat alat HPLC 1 set
 Lumpang dan alu 1 buah
 Spatula 1 buah
 Labu ukur 25 mL dan 10 mL 6 buah
 Neraca analitik 1 set
 Corong pendek 1 buah
 Pipet tetes 3 buah
 Gelas kimia 100 mL 1 buah
 Gelas ukur 500 mL 1 buah
 Ultrasonik Vibrator 1 set
2. Bahan
 Parasetamol p.a 6,2 mg
 Metanol 20 mL
 Sampel obat oskadon 1 strip
 KH2PO4 420 mL
 Isopropil alcohol 30 mL
 Asetonitril 30 mL
 Membran 2 buah
 Kertas saring Secukupnya
D. Prosedur Kerja Praktikum
1. Pembuatan Fasa Gerak
Dicampur KH2PO4 : Isopropil alcohol : methanol : asetonitril yang telah disaring
dengan sel membran dengan perbandingan masing-masing (420:30:20:30)mL.
Setelah itu, dihomogenkan dengan ultrasonic vibrator selama 15 menit.
2. Pembuatan Larutan Induk Parasetamol
Ditimbang parasetamol sebanyak 6,25 mg, setelah itu dilarutkan dengan 10 mL
fasa gerak (dilakukan secara kuantitatif dalam gelas kimia 20 mL). Kemudian
dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan dihomogenkan selama 5 menit
menggunakan ultrasonic vibrator, ditanda bataskan secara kuantitatif.
3. Pembuatan Deret Larutan Standar
Dibuat deret standar 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 dan 125,0 ppm dengan melakukan
pengenceran dari larutan induk yang telah dibuat kedalam labu ukur 10,0 mL,
kemudian didegassing selama 5 menit. Semua larutan standar masing-masing
disaringdengan menggunakan membrane PTFE, filtrate ditempatkan ke dalam
vial tertutup yang telah diberi label.
4. Pembuatan Larutan Sampel Parasetamol
Ditimbang satu per satu tablet parasetamol dalam 1 strip, kemudian digerus.
Setelah halus ditimbang 12,5 mg, dilarutkan dalam labu ukur 25 mL, ditambah
sedikit pelarut lalu dihomogenkan dengan ultrasonic vibrator selama 5 menit.
Setelah 5 menit, sampel di tandabataskan kemudian dihomogenkan. Sampel
yang sudah homogen dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukan ke dalam labu takar
10 mL, setelah itu disaring dengan kertas saring milipore, dan membrane PTFE,
filtrate dimasukan ke dalam botol vial. sebelum diinjekkan, larutan didegassing
terlebih dahulu selama 5 menit.
5. Prosedur Mengoperasikan HPLC
Instrumen HPLC dihidupkan kemudian dan kondisikan instrument HPLC sesuai
dengan:
Fasa gerak : KH2PO4 : Isopropil alcohol : methanol : asetonitril
(420:30:20:30)
Kolom : C-18 = 15 cm
 Panjang gelombang : 234 nm
Laju alir : 0,5 mL/menit
Volume injeksi : 20 μL
Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.
Setelah itu tekan tombol “ON” pada sakelar listrik. Isi botol fasa gerak dengan
volume memadai dan kosongkan botol penampung. Tekan tombol “ON” pada
alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa. Lakukan pemograman alat
dengan computer. Ikuti langkahnya sesuai dengan instruksi computer. Pilih
mode yang digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrument. Apabila
kromatogram telah menunjukkan base line mendatar, maka instrument siap
digunakan. Injeksikan larutan standar secarea berurutan (mulai dari konsentrasi
terendah) dan larutan sampel. Cetak hasil pengukuran dan catat kondisi
percobaannya. Stelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoroti
tanda pompa pada computer. Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.
Untuk mematikan, tekan tombol “OFF” pada pompa, detektor dan power secara
berurutan. Terakhir, putuskan sambungan listrik.

E. Hasil dan Analisi Data

 Hasil Percobaan
Data hasil analisis larutan standar I

Tabel Data Pengukuran Larutan deret Standar I

Konsentrasi (ppm) Waktu Retensi Luas Area

24,8 1,39 1007806

49,6 1,39 1895495

74,4 1,39 2667819

99,2 1,39 3316040

124 1,39 4099740

 Kurva kalibrasi larutan deret standar I

Kurva konsentrasi standar terhadap luas

area
4500000

4000000

3500000
Luas Area

3000000

2500000

2000000 y = 30662,9556x + 316072,10000

R² = 0.9974
1500000

1000000

500000

0
24,8 49,6 74,4 99,2 124

Konsentrasi standar (ppm)

Data hasil analisis larutan standar 2

Tabel Data Pengukuran Larutan deret Standar 2

Konsentrasi Waktu Retensi Luas Area

24,8 1,39 813607

49,6 1,39 1351640

74,4 1,39 2036587

99,2 1,39 2638557

124 1,39 3227353

 Kurva kalibrasi larutan deret standar 2

Kurva konsentrasi Standar terhadap

luas area
3500000

3000000 y = 24654,8750x + 179226,1000

R² = 0.999
2500000
Luas Area

2000000

1500000

1000000

500000

0
24,8 49,6 74,4 99,2 124

Konsentrasi standar (ppm)

 Penentuan Kadar Paracetamol dalam sampel obat

Berdasarkan kurva yang dihasilkan, maka persamaan garis yang digunakan
adalah kurva dari larutan standar 2 karena memberikan regresi paling tinggi,
persamaan garisnya yaitu :
y = 24654,8750x + 179226,1000 R2 = 0,999
Karena pada data pengukuran luas area sampel I dan sampel II memiliki
waktu retensi yang sama yaitu 1,39 sehingga luas area sampel dirata-ratakan.
Larutan sampel Luas Area
I 1246385
II 1307825
Rata-rata 1277105
Massa Sampel 12,5 mg

Dari hasil perhitungan (terlampir), diperoleh kadar parasetamol dalam

sampel %Parasetamol dalam sampel adalah 89,05% dan massa parasetamol dalam
oskadon adalah 626,217 mg/tablet.
 Analisis Data
Instrumen yang dipilih pada percobaan ini dalam penentuan kadar
parasetamol dalam sampel obat adalah kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC).
Teknik HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yaitu suatu
metode pemisahan dari suatu analit berdasarkan perbedaan interaksi antara fasa
diam dengan fasa geraknya. Teknik HPLC ini dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif dan kualitatif. Analisis kuantitatif dapat dilihat dari pengukuran luas
puncak/area dari analit pada kromatogram yang dibandingkan dengan luas area
standar dengan menggunakan kurva kalibrasi, pada percobaan kali ini digunakan
dua deret larutan standar. Analisis Kualitatif dapat dilihat dari waktu retensinya
yang dibandingkan dengan standar.
Instrumen HPLC ini dipilih untuk percobaan ini karena ada beberapa
pertimbangan dan keefektifan pekerjaan yang dilakukan dilaboratorium.
Pertimbangan itu antara lain dilihat dari sampel yang akan dianalisis nantinya.
Sampel yang dianalisis adalah obat yang memiliki kandungan parasetamol,
parasetamol merupakan zat yang tidak mudah menguap. Parasetamol mudah larut
ketika dilarutkan dalam air karena parasetamol merupakan senyawa yang bukan
ionik. Parasetamol memiliki berat molekul yang ringan. Dari beberapa data yang
menginformasikan sifat sampel, maka instrumentasi yang tepat digunakan adalah
HPLC dengan jenis kromatografi partisi (fasa terbalik).
Penggunaan jenis kromatografi fasa terbalik ini karena sampel yang akan
kita pisahkan bersifat polar, oleh karena itu dalam jenis kromatografi ini fasa gerak
yang digunakan memiliki sifat yang polar yaitu campuran antara KH2PO4 :
Isopropil alcohol : methanol : asetonitril dengan perbandingan 420:30:20:30 dan
fasa diamnya bersifat nonpolar biasanya fasa diam yang memiliki rantai alkil 8 (C-
8) atau 18 (C-18).
Pada perhitungan konsentrasi parasetamol,data yang terhitung adalah 248
ppm. Data seharusnya adalah 250 ppm,hal ini terjadi karena pada penimbangan
sampel adalah 6,2 mg yang seharusnya 6,25 mg, hal ini terjadi disebabkan Karena
digit dibelakang koma hanya satu angka, bukan dua angka. Sehingga pada
penimbangan sampel yang terbaca adalah 6,2 mg.Jadi hal ini perlu menghitung lagi
konsentrasi pada deret standar.
 Pada percobaan kali ini, dalam analisisnya perlu diperhatikan setiap
tahapnya agar kesalahan yang terjadi menjadi seminimal mungkin. Sampel uji
harus disaring dahulu dengan membrane PTFE agar tidak terjadi penyumbatan
dalam kolom dan menghilangkan udara atau gas dari pelarutnya. Karena jika
sampel masih ada gas yang terlarut dapat menyebabkan gangguan pada sistem
pengatur gradient dari eluennya.
Didalam Kolom itu komponen-komponen dipisahkan berdasarkan
perbedaan kekuatan interaksi solute terhadap fasa diamnya. Solut yang
berinteraksi kurang kuat maka akan keluar lebih lambat dari kolom daripada
solut yang lebih kuat interaksinya. Komponen itu selanjutnya keluar dari kolom
dengan kecepatan yang berbeda dan dideteksi oleh detector. Detektor yang
digunakan adalah detector UV.
Read out dari hasil analisis dengan HPLC adalah suatu kromatogram.
Kromatogram adalah grafik yang menghubungkan antara intensitas komponen
yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Banyaknya puncak
menunjukkan jumlah komponen,sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi.
Dari data kromatogram larutan standar, didapatkan waktu retensi 1,39.
Waktu retensi tersebut merupakan jangka waktu yang terukur saat sampel
melewati kolom HPLC. Dari data kromtogram sampel didapatkan dua puncak
yaitu puncak untuk paracetamol dan kafein. Puncak dari kafein lebih kecil dari
pada puncak paracetamol, karena kadar dari kafein dalam sampel obat oskadon
juga lebih sedikit. Pada percobaan kali ini,injeksi sampel dilakukan dua kali
untuk mendapatkan data yang akurat.
Setelah sampel diukur, didapat kromatogram dari sampel.Luas area yang
diperoleh dalam dua kali pengukuran yaitu 1246385 dan 1307825. Kemudian
dibuat kurva kalibrasi dari larutan standar yang menghasilkan persamaan y =
24654,8750x + 179226,1000 dengan regresi 0,999.
Setelah dilakukan pengolahan data, maka didapatlah kadar parasetamol
dalam obat oskadon adalah 89,05%. Dari berat rata-rata tablet oskadon sebesar
703,22 mg terkandung parasetamol sebesar 626,21741 mg. Sedangkan dalam
kemasan tertera bahwa kadar paracetamol dalam obat oskadon adalah 500 mg.
F. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan penetuan kadar parasetamol dalam sampel obat
oskadon menggunakan instrument HPLC didapatkan kadar parasetamol sebesar
89,05%,sehingga massa parasetamol dalam oskadon sebesar 626,21741 mg.
G. Daftar Pustaka
Harvey, David. (2000). Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw-Hill
Companies.
Hendayana, Sumar. (1994). Kmia Instrumen Edisi Kesatu. Semarang : IKIP
Semarang Press.
Hendayana, Sumar. (2006). KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.
Clark, Jim. (2007). “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)”. [Online].
Tersedia: http://www.chem-istry.org yang direkam pada 6-10-2007. [16
Desember 2010].
Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan Farmasi FMIPA USU.
Suhanda, Hokcu. (2001). Handout Perkuliahan Kimia Analitik Instrumen :
KCKT/HPLC. Jurusan Pendidikan Kimia UPI : tidak diterbitkan.
Tim Kimia Analitik Instrumen. (2010). Penuntun Praktikum Kimia Analitik
Instrumen (KI-431). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.
 LAMPIRAN

1. Perhitungan Pembuatan Larutan :

a. Perhitungan massa parasetamol dari konsentrasi parasetamol 248 ppm. :
Ppm = mg / L
248 ppm = mg / 2,5 x 10-3L
Massa = 6,2 mg
Jadi massa parasetamol adalah 6,2 mg.
b. Perhitungan massa KH2PO4
Diketahui : V = 420 mL
M = 0,01 M
Mr = 137
Penyelesaian :
g 1000
M= x
Mr V
g 1000
0,01 = x
137 420
g = 0,5754
c. Pembuatan larutan deret standar :
 V1 = 1 mL
V1.M1 = V2.M2
1 mL x 248 ppm = 10 mL x M2
M2 = 24,8 ppm
 V1 = 2 mL
V1.M1 = V2.M2
2 mL x 248 ppm = 10 mL x M2
M2 = 49,6 ppm
 V1 = 3 mL
V1.M1 = V2.M2
3 mL x 248 ppm = 10 mL x M2
M2 = 74,4 ppm
 V1 = 4 mL
V1.M1 = V2.M2
 4 mL x 248 ppm = 10 mL x M2
M2 = 99,2 ppm
 V1 = 5 mL
V1.M1 = V2.M2
5 mL x 248 ppm = 10 mL x M2
M2 = 124 ppm

2. Prosedur Mengoperasikan HPLC

Instrumen HPLC dihidupkan kemudian dan kondisikan instrument HPLC sesuai
dengan:
Fasa gerak : KH2PO4 : Isopropil alcohol : methanol : asetonitril
(420:30:20:30)
Kolom : C-18 = 15 cm
Panjang gelombang : 234 nm
Laju alir : 0,5 mL/menit
Volume injeksi : 20 μL
Temperatur : 33°C
Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.
Setelah itu tekan tombol “ON” pada sakelar listrik. Isi botol fasa gerak dengan
volume memadai dan kosongkan botol penampung. Tekan tombol “ON” pada
alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa. Lakukan pemograman alat
dengan computer. Ikuti langkahnya sesuai dengan instruksi computer. Pilih
mode yang digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrument. Apabila
kromatogram telah menunjukkan base line mendatar, maka instrument siap
digunakan. Injeksikan larutan standar secarea berurutan (mulai dari konsentrasi
terendah) dan larutan sampel. Cetak hasil pengukuran dan catat kondisi
percobaannya. Stelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoroti
tanda pompa pada computer. Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.
Untuk mematikan, tekan tombol “OFF” pada pompa, detektor dan power secara
berurutan. Terakhir, putuskan sambungan listrik.
 3. Data Pengamatan dan Pengolahan Data
Larutan Deret Standar I
Konsentrasi Waktu Luas
(ppm) Retensi Area
24,8 1,39 1007806
49,6 1,39 1895495
74,4 1,39 2667899
99,2 1,39 3316040
124 1,39 4099740

Kurva kalibrasi larutan deret standar I

Kurva konsentrasi standar terhadap luas

area
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
Luas Area

2000000
1500000 y = 30662,9556x + 316072,10000
R² = 0.9974
1000000
500000
0
24,8 49,6 74,4 99,2 124

Konsentrasi standar (ppm)

Larutan Deret Standar II
Konsentrasi Waktu Retensi Luas Area
24,8 1,39 813607
49,6 1,39 1351640
74,4 1,39 2036587
99,2 1,39 2638557
124 1,39 3227353
 Kurva kalibrasi larutan deret standar II

Kurva konsentrasi Standar terhadap

luas area
3500000
3000000
y = 24654,8750x + 179226,1000
2500000 R² = 0.999
Luas Area

2000000
1500000
1000000
500000
0
24,8 49,6 74,4 99,2 124

Konsentrasi standar (ppm)

Data Pengukuran Sampel

Larutan Luas
Waktu Retensi
sampel Area
I 1,39 1246385
II 1,39 1307825

Massa sampel obat oskadon

Tablet Massa (mg)
1 711,1
2 705,2
3 702,4
4 694,2
Jumlah 2812,9
Massa rata-rata 703,2
Berdasarkan kurva yang dihasilkan, maka yang digunakan untuk penentuan kadar
parasetamol dalam sampel adalah kurva dari larutan standar II mempunyai
persamaan :
y = 24654,8750x + 179226,1000 R2 = 0,999
Karena pada data pengukuran luas area sampel I dan sampel II memiliki waktu
retensi yang sama yaitu 1,39 sehingga luas area sampel dirata-ratakan.
Larutan sampel Luas Area
I 1246385
II 1307825
Rata-rata 1277105
Massa Sampel 12,5 mg

 Berdasarkan persamaan dari larutan standar II yang dihasilkan :

y = 24654,8750x + 179226,1000
1277105 = 24654,8750x + 179226,1000
24.654,8750X = 1.277.105 – 179.226,1
X = 44,52989 ppm
Jadi konsentrasi parasetamol dalam 10 mL larutan adalah 44,52989 ppm.
 Konsentrasi parasetamol dalam 25 mL (sebelum pengenceran) :
V1.M1 = V2.M2
1 mL x M1 = 10 mL x44,52989 ppm
M1 = 445,2989 ppm

Jadi konsentrasi parasetamol dalam 25 mL larutan (sebelum pengenceran) adalah

445,2989 ppm.
 Massa parasetamol dalam sampel :
Mg = 445,2989 ppm x 2,5 x 10-3L
Mg = 11,1324 mg
Jadi massa parasetamol dalam sampel adalah 11,1324 mg.
 Kadar parasetamol dalam sampel :
%Parasetamol = (Massa parasetamol / Massa sampel) x 100%
%Parasetamol = (11,1324 mg / 12,5 mg) x 100%
 %Parasetamol = 89,05 %
Jadi %Parasetamol dalam sampel adalah 89,05%.
 Massa parasetamol dalam obat oskadon :
Massa rata-rata tablet oskadon = 703,22 mg
Massa parasetamol = 89,05% x 703,22 mg
Massa parasetamol = 626,21741 mg
Jadi massa parasetamol dalam oskadon adalah 626,21741 mg.
4. Dokumentasi Foto Praktikum

Kolom

Komputer Cara memegang syringe

 Penginjeksian Proses Injeksi

Pompa

Instrumen HPLC