APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN

KADAR SEDIAAN OBAT

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik
kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau
padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode
lainnya yaitu mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran, mudah melaksanakannya, kecepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi /
kerusakan bahan yang dianalisis.
KCKT sangat cocok untuk memisahkan minyak atsiri dan
kadang-kadang menunjukkan keuntungan yang berarti kesetimbangan
metode kolom terbuka (kapiler) dan KG yang sekarang dipakai,
pendadahan keudara minimum, hasil urai karena suhu tinggi dicegah,
senyawa yang tidak atsiri dapat dipisahkan, dan laju perolehan
kembali cuplikan tinggi. Akan tetapi, minyak atsiri sering terdiri atas
campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa
atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponennya.
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan
pompa melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkanke dari gum
aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan
interaksi antara salut-salut terhadap fase diam akan keluar dari kolom
lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram. Senyawa yang keluar dari dari kolom atas dasar
kepolaran yang berbeda akan mempengaruhi kekuatan.
Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan
suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun inorganik,
sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah
suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
Pada praktikum kali ini dilakukan uji instrumentasi penetapan
kadar dari suatu sediaan obat dengan mengunakan aplikasi HPLC
(High performance liquid cromatograpy). Untuk melihat keefektivan
pengunaan alat ini secara analisis kualitatif maupun kuantitatif.
1.2 Maksud Praktikum
Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk mengetahui
cara analisis atau penetapan suatu sediaan obat dengan
menggunakan HPLC (High performance liquid cromatograpy).
1.3 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk menentukan
kadar suatu sediaan obat dengan menggunakan HPLC (High
performance liquid cromatograpy).

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran
tersebut diantarany dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase
bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair,
sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam
kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase
diam dapat berupa zat padat atau zat cair (Acun, 2010).
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan
untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran
senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi
zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti
adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi (Hendayana,
2006).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari
kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan,
kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan
pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern
bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan
yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang
berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya,
diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang
lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, 2002).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga
disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy )
dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an.
Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara
luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa
AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm
15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT,
penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis
protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa kiral
(Rohman, 2013).
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan
pompa melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkanke datigum
aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan
interaksi antara salut-salut terhadap fase diam akan keluar dari kolom
lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Lestari, 2014).
Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu
cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus
tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak,
statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari
campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata
antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya.
Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak
(bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan
dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut
pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah
pemisahan diantara komponen-komponen yang ada (Hendayana,
2006).
Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi HPLC sehingga
menjadikannya sebagai “the best choice” dalam dunia
penentuan/pemisahan ion/logam, di antaranya (Adrianingsih, 2011) :
a. Kecepatan (speed)
Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang
sangat penting dalam hal analisis ion yaitu untuk mengurangi biaya,

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
bisa mengahsilkan data analisis yang akurat dan cepat dan bisa
mengurangi limbah (waste) yang dihasilkan dari penggunaan eluen.
b. Sensitivitas (sensitivity)
Perkembangan rehnologi mikro prosessor yang dikombinasikan
dengan efisiensi kolom pemisah, mulai ukuran diameter dalam
milimeter sampai skala mikro yang biasa juga disebut microcolumn,
membuat pendeteksian ion dalam sampel menjadi lebih baik,
meskipun jumlah sampel yang diinjeksikan ke dalam kolom
pemisah sangat sedikit.
c. Selektivitas (selectivity)
Dengan sistem ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan
keinginan, misalnya kation/anion organik saja atau kation/anion
anorganik yang ingin dipisahkan. Itu dapat dilakukan dengan
memilih kolom pemisah yang tepat.
d. Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection)
Teknik pendeteksian sekali injeksi untuk sebuah sampel seperti
ini penting untuk dilakukan karena tentunya mempunyai sejumlah
kelebihan dibanding pemisahan terpisah. Sebagaimana telah diulas
diatas, beberapa kelebihan di antaranya dapat menekan biaya
operasional, memperkecil jumlah limbah saat analisis (short time
analysis) serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan.
e. Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column)
Walaupun sebenarnya, ketahanan kolom ini berdasarkan pada
paking (packing) material yang diidikan ke dalam kolom pemsiah
bisa bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya
konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan mempengaruhi
kestanilan material penyusun kolom pemisah yang mempunyai
waktu penggunaan yang tidak terlalu lama, dikarenakan kemasan
kolom yang kurang baik atau karena faktor internal lainnya.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom,

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer
atau integrator atau perekam (Unang, 2010).
2.2 Uraian Bahan
1. Asam asetat (Ditjen POM, 1979 : 42)
Nama resmi : ACIDUM ACETICUM GLACIALE
Nama lain : Asam asetat glacial
RM/BM : C2H2O2 / 60,05

Rumus struktur :
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas,
tajam, jika diencerkan dengan air, rasa
asam
Kelarutan : Dapat campur dengan air, dengan
etanol (95%) P dan dengan gliserol P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Zat tambahan
2. Natrium Asetat (Ditjen POM, 1995 : 709)
Nama resmi : NATRII ACETICUM
Nama lain : Natrium Asetat
RM/BM : CH3COONa/93,52
Pemerian : Serbuk atau massa puith keabuan,
higroskopik.
Kelarutan : Larut baik dalam air.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai zat tambahan
3. Parasetamol (Ditjen POM,1979 : 37)
Nama Resmi : ACETAMINOPHEUM
Nama Lain : Asetaminofen, Parasetamol
RM/BM : C8H9NO2/151,16

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT

Rumus Struktur :

Pemerian : Hablur atau serbuk hablur putih; tidak

berwarna; rasa pahit.
Kelarutan : Larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian
etanol (95%) P, dalam 13 bagian aseton P,
dalam 40 bagian gliderol P, dan dalam 9
bagian propilenglikol P, larut dalam larutan
alkali hidroksida.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindungi dari
cahaya.
Kegunaan : Analgetikum; Antipiretikum
4. Miconazole
Merek dagang : Miconazole, Clearderma, Daktarin, Daktazol,
Fungitia, Funtas, Goderm, Kalpanax-K.
Komposisi : Miconazole nitrat 20 mg
Indikasi : Kulit dan kuku infeksi yang disebabkan oleh
dermatophytes, yeastsnand berbagai jamur
lain, misalnya. tinea capitis, tinea corporis,
tinea manum, tinea pedis.
2.3 Prosedur Kerja (Anonim, 2016)
1.3.1 Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Eksternal
(i) Menggunakan kolom ODS (oktadesisilen,C18) : diameter
4,6 mm dan panjang 150 mm.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
(ii) Fase gerak : campuran dari asetonitril : asam asetat 0,05 M
(85:15).
(iii) Kecepatan alir 1 mL/menit
Prosedur :
1. Timbang 125 mg parasetamol baku dimasukkan dalam labu
takar 250 mL dan diencerkan dengan larutan asam asetat
0,005 M sampai tanda batas (larutan stok).
2. Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret
konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL.
3. Dilakukan penetapan kadar kelima larutan standar diatas
dengan HPLC.
4. Ditimbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis,
adalah 12,1891 gram.
5. Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam
asetat 0,05 M dalam labu takar 250 mL, lalu disaring.
6. Dipipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam asetat 0,05
M sampai 100 mL dalam labu takar. Selanjutnya, larutan
diencerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam
labu takar 100 mL dengan larutan asam asetat 0,05 M
sampai tanda batas.
7. Larutan, dilakukan penetapan menggunakan kromatografi
HPLC pada kondisi sama pada larutan baku. Adapun
hasilnya diperoleh luas puncak kromatogram = 45.205.
8. Tetapan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam
Farmakope Indonesia.
1.3.2 Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Internal Econazole
(i) Menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang
150 mm.
(ii) Fae gerak : campuran asetonitril : buffer pH 4,0 Na. Asetat
0,1 M (70:30).

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
(iii) Kecepatan alir 1 Ml/menit
Prosedur :
1. Buat larutan standar miconazole nitrat dan econazole nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0
mg. Kemudiaan, masing-masing dilarutkan dengan larutan
fase gerak sampai 250 mL dalam labu takar.
2. Pipet 25 mL larutan econazole stok standar masukkan ke
dalam lima buah labu takar 100 mL. Selanjutnya, pada
kelima labu takar tersebut ditambahkan larutan stok standar
miconazole masing-masing 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL,
dan 35 mL. Lalu encerkan dengan larutan fase gerak
hingga tanda batas.
3. Kelima deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing
dilakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC.
4. Sampel krim yang diuji mengandung miconazole nitrat 20
mg dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazole adalah
1,0368 g, berat krim yang digunakan untuk analisis adalah
201,5 mg.
5. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 mL larutan
fase gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5
menit. Ekstraksi dengan 50 mL heksan dari lapisan heksan
dikeluarkan/dibuang. Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen
untuk menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan
ke dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan sampai batas
dengan larutan fase gerak. Saring larutan dan pipet
sebanyak 20 mL untuk dilakukan pengukuran kromatografi
HPLC mrnggunakan detector pada UV pada panjang
gelombang 220 nm.
6. Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, sebagai berikut :
a. Luas puncak kromatografi sampel miconazole =
119.923.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
b. Luas puncak kromatografi pembanding econazole =
124.118.
7. Hitung persentase kadar miconazole dalam krim dan
tetapkan persyaratan sediaan krim miconazole yang tertera
dalam Farmakope Indonesia.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
BAB 3 METODE KERJA

3.1 Alat Praktikum

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum yaitu batang
pengaduk, corong penyaring, detector, erlenmeyer, gelas piala, kertas
pH universal, labu takar 100 dan 250 mL, pipet volum 10 dan 25 mL,
sendok tanduk dan timbangan analitik (Neraca).
3.2 Bahan Praktikum
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu asam
asetat, econazole, miconazole, natrium asetat, parasetamol dan
tissue.
3.3 Cara Kerja (Anonim, 2016)
1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Eksternal
 Menggunakankolom ODS (Oktadesilsilen, C18) : diameter 4,6
mm danpanjang 150 mm.
 Fasegerak : Campurandariasetonitril :asamasetat 0,05 M (85 :
15).
 Kecepatanalir 1 mL/menit.
Prosedur :
a. Ditimbang 125 mg parasetamol baku dimaksudkan dalam labu
takar 250 ml dan diencerkan dengan larutan asam asetat 0,05 M
sampai tanda batas. (larutan stok).
b. Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi
0,5, 1,0, 1,5, 2,0 dan 2,5 mg/100 ml.
c. Dilakukan penetapan kelima larutan standar di atas dengan
HPLC.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
Concentration of Area of chromatographic
paracetamol standard peak
solution mg/ 100 ml
0,5044 17 994
1,009 36 109
1,513 54 121
2,018 71 988
2,522 89 984
Pers. Linear : y = 35656,586x + 80,803 : r = 1,000
d. Timbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah
12,1891 gram
e. Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat
0,05 M sampai 100 ml dalam labu takar dengan larutan asam
asetat 0,05 M sampai tanda batas.
f. Larutan, dilakukan penetapan mengunakan diperoleh luas
puncak kromatogram = 45.000
g. Tetapkan tablet parasetamol sesuai persyaratan sesuai
persyaratan tablet dalam Farmakope Indonesia.
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar Internal
Econazol
 MenggunakankolomODS : diameter 4,6 mm danpanjang 150
mm.
 Fasegerak : campuranasetonitril : buffer pH 4,0 Na. Asetat 0,1 M
(70 : 30)
 Kecepatanalir 1 mL/menit.
Prosedur :
a. Buat larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg.
Kemudian, masing-masing dilarutkan dengan larutan fase gerak
sampai 250 ml dalam labu takar.
b. Pipet 25 ml larutan econazol stok standar masukkan ke dalam
lima buah labu takar 100 ml. Selanjutnya, pada kelima labu takar
tersebut ditambahkan larutan stok standar miconazol masing-

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
masing 15 ml, 20 ml, 30 ml, dan 35 ml, lalu encerkan dengan
larutan fase gerak hingga tanda batas.
c. Kelima deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing
dilakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC.
Concentrartion of Area of Area of Area miconazole
miconazole in miconazole econazole Area econazole
calibration peak peak
solution mg/100ml
12,09 70 655 123 563 0,5718
16,12 96 218 125 376 0,7674
20,15 119 793 126 783 0,9449
24,18 151 310 127 889 1,183
28,21 166 673 125 436 1,329
Pers. Linear : y = 0,048x – 0,006 : r = 0,998
Data pengamatan :
 Berat miconazol yang digunakan membuat larutan stok =
201,5 mg
 Berat krim untuk dianalisis = 1,0368 g
d. Sampel krim yang diuji mengandung miconazol nitrat 20 mg
dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazol adalah 1,0368
g., berat krim yang digunakan untuk analisis adalah 201,5 mh.
e. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 ml larutan fase
gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit.
Ekstraksi dengan 50 ml heksan dan lapisan heksan dikeluarkan/
dibuang. Larutkan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk
menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan ke dalam
labu takar 100 ml dan diencerkan sampai batas dengan larutan
fase gerak. Saring larutan dan pipet sebanyak 20 ml untuk
dilakukan pengukuran kromatografi HPLC menggunakan
detektor UV pada panjang gelombang 220 nm.
f. Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, seperti berikut :
 Luas puncak kromatogram sampel miconazol = 119 923
 Luas puncak kromatogram pembanding econazol = 124 118

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
g. Hitung persentase kadar miconazol dalam krim dan tetapkan
berdasarkan persyaratan sediaan krim miconazol yang tertera
dalam Farmakope Indonesia.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Eksternal
A. Tabel
Data obtained from the analysis of paracetamol standard
solutions by HPLC
Consetration of paracetamol
standard solution (mg/100 Area of chromatographic peak
mL)
0,5044 17.994
1,009 36.109
1,513 54.121
2,018 71.988
2,522 89.984
Persamaan Linear : y = 35656,585x + 80,803 ; r = 1,000
B. Kurva Baku

Tablet Parasetamol
100,000
y = 35657x + 80.803
80,000 R² = 1
60,000
Area

40,000 Series1

20,000 Linear (Series1)

0
0 1 2 3
Konsentasi

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Econazole
1. Tabel
Consetration of Area of Area of Area miconazole
miconazole in miconazole econazole Area econazole
calibration solution peak peak
(mg/100 mL)
12,09 70.655 123.563 0,5718
16,12 96.218 125.376 0,7674
20,15 119.793 126.783 0,9449
24,18 151.310 127.889 1,183
28,21 166.673 125.436 1,329
Persamaan Linear : y = 0,0048x -0,006 ; r = 0,998
2. Kurva Baku

Krim Miconazole
1.6
y = 0.0479x - 0.0058
Area Miconazole/Econazole

1.4
R² = 0.9962
1.2
1
0.8
Series1
0.6
Linear (Series1)
0.4
0.2
0
0 10 20 30
Konsentrasi

4.2 Pembahasan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga
disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy)
merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel. Fungsi

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
dari HPLC yaitu untuk mengukur senyawa-senyawa kualitatif (waktu
retensi) dan kuantitatif (luas area dan tinggi puncak).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair,
yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun
analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan
pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode
pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data
yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar.
Bagian-bagian HPLC dibagi menjadi enam bagian yaitu :
1. eluen, berfungsi sebagai fase gerak yang membawa sampel masuk
kedalam kolom.
2. pompa, berfungsi mendorong eluent dan sampel masuk kedalam
kolom
3. injektor, berfungsi sebagai tempat memasukkan sampel dan dapat
didistribusikan masuk kedalam
4. kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada
dalam sampel
5. detektor, untuk membaca ion yang lewat dalam detektor
6. rekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang
masuk.
Prinsip HPLC yaitu adsorbsi dan partisi. Adsobsi yaitu
penyerapan senyawa-senyawa menggunakan fase diam, dimana
kemampuan suatu senyawa untuk terikat pada silika gel dan partisi
yaitu pemisahan berdasarkan polaritas menggunakan fase gerak.
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar
sediaan obat menggunakan kromatografi HPLC. Ada dua metode
yang digunakan yaitu metode standar eksternal dan metode standar
internal econazole.
Pada penetapan kadar sediaan obat Miconazole dilakukan
dengan metode standar internal Econazole, digunakan kolom
oksidesilsilen, dengan fase gerak berupa campuran asetonitril : buffer

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
pH 4,0 Na.Asetat 0,1 M dengan perbandingan 70:30, dan kecepatan
alir nya 1 mL/ menit. Setelah dilakukan analisis kromatografi HPLC,
diperoleh luas puncak kromatogram sampel Miconazole adalah
119923, dan luas puncak kromatogram pembanding econazol adalah
124 118, sehingga dengan menggunakan rumus persen kadar,
diperoleh kadar Miconazole dengan metode standar internal Econazol
adalah 240,983%.
Adapun hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan literatur yaitu
krim miconazole mengandung tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih
dari 110,0% dari yang tertera pada etiket.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT

BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan dari analisis kadar menggunakan metode
kromatografi HPLC, dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol
dengan metode standar eksternal adalah -14,427%. Dan kadar
Miconazole dengan metode standar internal Econazol adalah
240,983%.
5.2 Saran
Sebaiknya praktikan semua bekerja pada saat melakukan
praktikum serta alat dan bahan disiapkan sebelum praktikum
berlangsung agar dapat memaksimalkan waktu selama praktikum.
.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT

DAFTAR PUSTAKA
Acun., Sodiyc. 2010, Kromatografi Gas, Jakarta

Andrianingsih, R., 2011, Penggunaan High Performamance Liquid

Chromatography (HPLC) Dalam Proses Analisa Deteksi Ion,
Peneliti Bidang Material Dirgantara, Pusterapan.

Anonim., 2016, Penuntun Praktikum Analisis Instrumen, UMI, Makassar.

Ditjen POM, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III , Deperteman

Kesehatan RI, Jakarta.

Ditjen POM, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan

RI, Jakarta.

Hendayana, Sumar., 2006, KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan

Elektroforensis Modern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung.

Lestari, Wahyuni Sri, 2014, Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren

dalam Plasma darah secara In Vitro Menggunakan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT). UIN Syarif Hidayatullah: Jakarta

Rohman, Abdul., 2013, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka Pelajar : Jakarta

Unang, S., 2010, Elusidasi Struktur Senyawa Organik, Widya Padjajaran :

Bandung.

Underwood, Day, R.A., A.L, 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta:

Erlangga.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
LAMPIRAN
PERHITUNGAN
1. Penetapan Kadar Parasetamol dengan metode Standar Eksternal
150, 5 mg 250 mL

25 mL 100 mL (4x)

10 mL 100 mL (10x)
fp = 4 x 10 = 40 mg/mL
𝑦 = 35656,585x + 80,803 ; r = 1,000
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥
𝑦−𝑎
𝑥=
𝑏
3,383 − 80,803
𝑥=
35656,585
𝑥 = −0.00217126794 mg/mL
𝐶𝑥 𝑉
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 𝑓𝑝 𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
−0.00217126794 𝑥 250
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 40 𝑥 100%
150,5 𝑚𝑔
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = −14,427%

2. Penetapan Kadar Parasetamol dengan metode Standar Eksternal

200,0 mg 250 mL (800 ppm)

25 mL 100 mL (4x)
𝑦 = 0,048x − 0,006 ; r = 0,998𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥
𝑦−𝑎
𝑥=
𝑏
119,923 + 0,006
𝑥=
0,048
𝑥 = 2498.52 mg/mL

𝐶𝑥 𝑉
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 𝑓𝑝 𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm
15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
2498.52 𝑥 250
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 4 𝑥 100%
1036,8 𝑚𝑔
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 240,983%

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
SKEMA KERJA
1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Eksternal
Timbang 125 mg parasetamol baku dimasukkan dalam labu takar
250 mL

Encerkan dengan larutan asam asetat 0,005 M sampai tanda batas

(larutan stok)

Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi
0,5, 1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL

Lakukan penetapan kadar kelima larutan standar diatas dengan

HPLC

Timbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah

12,1891 gram

Ambil 150,5 mg serbuk tablet

Larutkan dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar 250 mL

Lalu disaring

Pipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam asetat 0,05 M

sampai 100 mL dalam labu takar

Encerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu takar

100 mL dengan larutan asam asetat 0,05 M

Lakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Internal Econazole
Timbang miconazole nitrat dan econazole nitrat (standar internal)
masing-masing 200,0 mg

Larutkan masing-masing dengan larutan fase gerak sampai 250 mL

dalam labu takar

Pipet 25 mL larutan econazole stok standar masukkan ke dalam lima

buah labu takar 100 mL

Tambahkan larutan stok standar miconazole masing-masing 15 mL,

20 mL, 25 mL, 30 mL, dan 35 mL

Encerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas

Lakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC

Sampel krim yang diuji mengandung miconazole nitrat 20 mg dalam

1000 mg krim (2%)

Berat krim miconazole adalah 1,0368 g

Timbang 201,5 mg krim

Larutkan dengan 25 mL larutan fase gerak dalam corong pisah

sambil dikocok selama 5 menit

Ekstraksi dengan 50 mL heksan dari lapisan heksan

dikeluarkan/dibuang

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk menghilangkan sisa
heksan

Masukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan sampai batas

dengan larutan fase gerak

Disaring larutan

Pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan pengukuran kromatografi

HPLC menggunakan detektor pada UV pada panjang gelombang
220 nm

Hitung persentase kadar miconazole dalam krim

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
LAMPIRAN
Pertanyaan kelompok 1
1. Jelaskan fungsi penghambat alat HPLC secara spesifik?
Jawab:
2. Fungsi dari jenis- jenis kolom dan syaratnya?
Jawab:
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat
fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom
mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.
3. Apa saja jenis-jenis detector danfungsinya?
Jawab:
Detektor, berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor.
4. Jelaskan syarat-syarat pelarut yang digunakan dalam reservoir pelarut?
Jawab:
5. Apa yang dimaksud dengan ods?
Jawab:
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
6. Apa saja rangkaian alat yang biasa dipakai untuk kromatografo ion?
Jawab:

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
Alat atau komponen dasar yang biasa dipakai dalam tehnik
kromatografi ion terdiri atas:
a. Eluent, yang berfungsi sebagai fase gerak yang akam membawa
sampel tersebut masuk ke dalam kolom pemisah.
b. Pompa, yang berfungsi untuk mendorong eluent, dan sampel
tersebut masuk ke dalam kolom.
c. Injector, tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat
didistribusikan masuk ke dalam kolom.
d. Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada
dalam sampel, keterpaduan antara kolom dan eluent bias
memberikan hasil/puncak yang maksimal, begitupun sebaliknya, jika
tidak ada “kecocokan” maka tidak akan memunculkan puncak.
e. Detektor, berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor.
f. Rekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang
masuk.

Pertanyaan kelompok 2
1. Kenapa di pompa melalui injector? Kenapa bukan melalui kolom saja?
Jawab:
Dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan melalui kolom ke
detektor. Sampel yang dilarutkan dalam solvent, dimasukkan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara unjektor (kesalahan dalam penjelasan
awal).
2. Hal apa saja yang dapat mempengaruhi waktu sampel menuju
detektornya?
Jawab:
3. Bagaimana prinsip kerja dari mekanisme yang dijelaskan tadi?
Jawab:
Prinsip dari mekanisme yang dijelaskan yaitu fase gerak yang
dipompa di bawah tekanan melalu kolom baja yang mengandung
partikel fase diam yang berdiameter 3-10 nm.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
4. Jelaskan bahaimana mekanisme kerja dari HPLC?
Jawab:
Dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan melalui kolom ke
detektor. Sampel yang dilarutkan dalam solvent, dimasukkan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara unjektor. Di dalam kolom terjadi
pemisahan komponen2 campuran  perbedaan kekuatan interaksi
anatara analat (solut-solut) dengan stationary phase pada kolom.

Pertanyaan kelompok 3
1. Mengapa HPLC bisa digunakan untuk bahan yang tidak tahan panas?
Jawab:
Karena HPLC digunakan pada suhu kamar, sehingga aman bagi
senyawa yang tidak tahan panas.
2. Bagaimana pengaruh ukuran partikel dengan hasil pemisahannya?
Jawab:
Semakin kecil ukuran partikel maka semakin besar luas
permukaan sehingga potensi berkontaknya sampel dengan eluent
semakinbesar. Dan bisa diperoleh pemisahan sampel yang maksimal.
3. Maksud dari persiapan sampel ?
Jawab:
a. Bebas dari gangguan-gangguan
b. Tidak berdampak buruk pada kolom
c. Cocok dengan metode HPLC,pelarut sampel akan melarut dalam
fase pembawa tanpa menganggu sampel yang diuji.

Pertanyaan kelompok 4
1. Apa yang dimaksud dengan pendeteksian serempak?
Jawab:
Pendeteksian serempak adalah teknik pendeteksian sekali injeksi
untuk sebuah sampel seperti ini penting untuk dilakukan karena

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN
KADAR SEDIAAN OBAT
tentunya mempunyai sejumlah kelebihan dibandingkan pemisaha
terpisah.
2. Mengapa harus di encerkan 2 kali?
Jawab:
Dilakukan pengenceran 2 kali karena sudah sesuai dengan
prosedur kerja dan dilakukan pengenceran dua kali agar mendapatkan
perbandingan dari pengenceran pertama dan kedua.

AYU MELINDA RHEYTNO A.W, S.Farm

15020140081