Anda di halaman 1dari 14

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

( HPLC )

LAPORAN TETAP PRAKTIKUM

KIMIA ANALITIK INSTRUMEN


DISUSUN

OLEH :

Kelompok: III ( 3.KC )


Guhartini (NIM 061430401224)
Liza Novriani (NIM 061430401227)
Ralli Artindah (NIM 061430401233)
Samapta Probowisnu (NIM 061430401236)
Siti Rahayu (NIM 061430401241)
Dwi Indah Mayasari (NIM 061430401989)

INSTRUKTUR : Ir. Erwana Dewi, M.Eng

JURUSAN TEKNIK KIMIA


POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA
2015
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
( HPLC )

A. Tujuan
- Dapat menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi.
- Dapat mengoperasikan alat kromatografi cair kinerja tinggi dengan baik
dan benar.
- Dapat menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun
kuantitatif menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.

B. Alat dan bahan yang Digunakan


Alat yang Digunakan :
- Serangkat alat HPLC yang dilengkapi dengan injector dan pencetak
kromatografi.
- Kolom Linchosphere.
- Syringe
- Penyaring milipone.
Bahan yang Digunakan :
- Cairan blanko yang mengandung caffeine.

C. Gambar Alat (Terlampir)


D. Dasar Teori
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam
kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada
salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan
kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan
atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang
berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi
(terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas
yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak
(bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-
komponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-
komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-
komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu
teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat
cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam
bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar.
Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang
menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar.
Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji,
dkk. 2010 : 17).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan,
keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan
teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era
peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan
pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang
berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan
harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang
beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal
digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran
sampai 3-5 m (1m = 10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan

tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak

melalui kolom tersebut.


Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja
telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah
menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai
kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah,
dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif.
Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam
yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom.
Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom
ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar
seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6
mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-
250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom
akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan
senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar
kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa
diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut
HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika
dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna
rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom
karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat
antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui
kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai
hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-
molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar
akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-
molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan
gugus hidrokarbon.
Komponen instrumentasi penyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi :
a) Reservoir Pelarut
Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut
organik seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti
metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau
fasa terbalik atau metode kromatografilainnya.
Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau
mempunyai lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-
campuran pelarut dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu
programener, maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan
untuk melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama
pengelusian.
Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian
sehingga campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa
denyutan (pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 10 mL/menit. Gas
yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih
dahulu (de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari
partikel-partikel kecil yang tidak larut.
Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10
m) untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam
kolom. Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan.
Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC
adalah jenis pompa isap dan tekan (reciprocating).
Pompa isap dan tekan yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang
tetap. Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu
untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan
yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap
yang masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap
memppunyai dua katup pengendali.
Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan
kemudian ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi
bergradien diperlukan dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu
atau dua penghisap. Ada dua macam rancangan utama pompa gradien yaitu
pecampuran tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan
pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu pompa.
Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran
tekanan tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing
pompa menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur
kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan
dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu
pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap
mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah
hanya mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya
diperlukan satu pompa. Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai
pengendali gradien.
Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu
campuran terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi
untuk melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-
katup pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama
langkah pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

b) Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya
pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya
kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen
yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC
dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom
pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada
keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion.
Kolom utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm
dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena
letaknya sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm
dengan diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar
dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu:
menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa
gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok :
- Kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan,
untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan
mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
- Kolom preparative
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.
c) Pompa
Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair
melalui kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi
dalam metode ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang
akan sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh
karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan
bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus
memenuhi persyaratan sebagai berikut :
Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
Bahan tahan korosi
Keluaran bebas pulse

d) Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem
(kolom) kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu
diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi
hasil eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-
operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan
(handle) penyuntik diputar dari posisi load (pengisap) ke posisi inject
(suntik). Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang
terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar cepat
agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar
cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan
posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya
terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom.
Masalahnya kebanyakan memasukan cuplikan kedalam kolom dapat
menyebabkan band broadening. Oleh karen itu cuplikan yang dimasukkan harus
sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam
sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang
syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan
injeksi stringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka
dan cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah
menyambung kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk
memasukkan cuplikan kedalam fasa gerak perlu dua langkah : sejumlah
volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan posisi load. Cuplikan
masih berada dalam loop ; kran diputar untuk mengubah posisi load
menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan kedalam kolom
(kran cuplikan)
Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak
digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2
langkah, yaitu: sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam
posisi load, cuplikan masih berada dalam loop; kran diputar untuk
mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa
cuplikan ke dalam kolom.
e) Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka
terhadap golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu
detektor yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya.
Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah :
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-
senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang
gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih
sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan,
karena sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak
senyawa yang di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi
bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada
panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat
dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang
gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang
gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor
jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo
tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada
berbagai panjang gelombang.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis
apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah
perubahan indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor
ini bersifat tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum
10-6 g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini
tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam
kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks
bias :
1. Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga
homogen dan bebaskan dari gas terlarutnya.
2. Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan
sampai detektor stabil.
3. Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka
tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir.
4. Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam
(inner diameter) yang besar tapi pendek.
5. Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
6. Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
6. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen.
Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt)
analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif
depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan
metode standar kalibrasi.
Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari
sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom)
HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18
atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya
(gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada
kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi
karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak
pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil
pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu
menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai
molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik
didih yang sangat tinggi seperti polimer.
Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui
kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke
dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi
antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut
yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama.
Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Gambar Skema Instrumentasi HPLC
E. Analisis Percobaan

Praktikum kali ini yang dilakukan adalah menganalisa sample caffeine


menggunkana alat penyerap yang bernama High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau yang lebih dikenal dengan kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT). Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-
analit berdasarkan kepolarannya, alat yang terdiri dari kolom (sebagai fase diam)
dan larutan tertentu sebagai fase geraknya. Yang paling membedakan HPLC
dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fase geraknya. Campuran analit akan terpisah berdasarkan teramati
pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Untuk skala polaritas : golongan
fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhelogenasi < golongan eter ~
golongan ester < golongan keton ~ golongan aldehida < golongan alkohol <
golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses


kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah melihat Retention
Time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya
adalah sebagai peak milik analit. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat
adalah spectrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai
spectrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spectrum 3D antara dua zat berbed,
maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan meskipun
memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen


yang dianalisis didalam sample. Yang berperan dalam proses separasi pada systm
HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis amalisa,
misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein,
lavastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk
tujuan analisa tertentu missal kolom zorbax carbohidrat (agilent) untuk analisa
karbohidrat (mono- , di-, polisakarida)
Setelah komponen dalam sampel berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya
adalah identifikasi. Hasil analisa HPLC brupa kromatogram. Dalam kromatogram
akaan terdapat peak-peak yang mengambarkan banyak jenis komponen dalam
sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak
saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan meyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentreasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample dilakukan
tahapan reperasi yang rumit. Saat ini HPLC atau KCKT merupakan cara
pemisahan yang secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sample apada sejumlah bidang diantaranya : farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan.

F. Kesimpulan
HPLC atau High Performance Liquid Chromatography merupakan teknik
pemisahan yang dilakukan berdasarkan sifat kepolaran masing-masing
komponen dalam analit terhadap fase geraknya.
Kegunaan umum HPLC untuk pemisahan sejumlah senyawa organic,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmakmuran, analisis
senyawa-senyawa mudah menguap, penentuan molekul-molekul netral,
amupun zwitter ion, dan lainnya.
Analisa caffeine yang dilakukan harus terhindar dari adanya gelembung-
gelembung atau gas udara dalam penganalisaan dari awal hingga akhir
agar pembacaan detector tidak terganggu dan hasilnya tidak kacau.
Read time caffeine dalam analisa ialah 4,57 menit dengan tinggi 141,514
mAu dan area 18,534 mAu*min
G. Daftar Pustaka
Kasie Laboratorium Kimia Analitik Instrumen. Penuntun Praktikum KAI :
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). 2015. Palembang :
Politeknik Negeri Sriwijaya.
Ir. Muhammad Taufik, M.Si, dkk. Modul Kimia Analitik Instrumen. 2015.
Palembang: Politeknik Negeri Sriwijaya