KROMATOGRAFI

DIAH PRIHATININGSIH
Tahukah anda ???

Kromatografi itu ???

 Pengertian Kromatografi
Kromatografi secara umum.

Teknik Suatu menjadi

pemisahan campuran Komponen

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan

campuran menjadi komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-
masing komponen.
Jenis-jenis Kromatografi
Berdasarkan Teknik Kerja
yang digunakan, antara lain :
1. Kromatografi Kertas
2.Kromatografi Kolom
3.Kromatografi Lapis Tipis
4.Kromatografi Gas
 A. Kromatografi Kertas
• Kromatografi kertas adalah
kromatografi yang menggunakan kertas
selulosa murni yang mempunyai
afinitas besar terhadap air atau
pelarut polar lainnya.

• Kromatografi kertas digunakan untuk

memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya.
 Prinsip Kerja
Kromatografi Kertas
Pelarut bergerak lambat pada
kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda
dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan
bercak warna.
 Cara penggunaan
Kromatogarfi kertas
Kertas yang digunakan adalah Kertas Whatman No.1.

Sampel diteteskan pada garis dasar kromatografi kertas.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi pelarut dan

terjenuhkan oleh uap pelarut.

Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan penguapan pelarut

sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.
Gambar Kromatografi
Kertas
B. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah

kromatografi yang menggunakan
kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen
dalam campuran.
 Prinsip Kerja
Kromatografi Kolom
• Didasarkan pada absorbsi komponen2
campuran dengan afinitas berbeda terhadap
permukaan fase diam.
• Absorben bertindak sebagai fase diam
dan fase geraknya adalah cairan yang
mengalir membawa komponen campuran
sepanjang kolom.
• Sampel yang mempunyai afinitas besar
terhadap absorben akan secara selektif
tertahan dan afinitasnya paling kecil akan
mengikuti aliran pelarut.
 Cara Penggunaan
Kromatografi Kolom
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan
melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam
adsorben (bahan penyerap).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi
satu macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan
sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.
Gambar kromatogafi kolom
C. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan

campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya yang digunakan.

Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk

memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang
sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
 Prinsip kerja Kromatografi
Lapis Tipis
• KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika
atau alumina yang seragam pada sebuah
lempeng gelas atau logam atau plastik yang
keras.
• Jel silika (atau alumina) merupakan fase
diam.
• Fase gerak merupakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.
• Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan
warna yang merupakan gabungan dari
beberapa zat pewarna.
 Cara Penggunaan
Kromatografi Lapis Tipis

Pada cara penggunaan KLT hampir

sama dengan penggunaan
Kromatografi kertas, hanya saja
pada KLT fase diamnya
menggunakan plat gelas/ logam/
Aluminium foil sedangkan pada
kromatografi kertas menggunakan
kertas saring.
Gambar Kromatografi
Lapis Tipis
D. Kromatografi Gas
Kromatografi gas adalah proses
pemisahan campuran menjadi
komponen- komponennya dengan
menggunakan gas sebagai fase
bergerak yang melewati suatu
lapisan serapan (sorben) yang diam.
 Prinsip Kerja
Kromatografi Gas
• Gas pembawa (biasanya menggunakan
helium, argon / nitrogen) dengan
tekanan tertentun dialirkan secara
konstan melalui kolom yang berisi
fase diam.
• Komponen sampel akan terabsorbsi
oleh fase dim dengan kecepatan
berbeda.
Gambar Kromatografi gas
 Cara Penggunaan
Krromatografi Gas
1. Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah
diatur.
2. Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh
aliran gas pembawa menuju kolom.
3. Sehingga komponen akan terabsorbsi oleh fase
diam sampai terjadi pemisahan.
4. Komponen yang terpisah menuju detektor akan
menghasilkan sinyal listrik yang besarnya
proporsional.
5. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh
amplifier.
6. Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa
puncak.
 Cara Memelihara
Kromatografi
1. Pada kromatografi kertas & kromatografi
lapis tipis, fase diam harus disimpan dalam
ruang tertutup atau di tempat yang
kering jauh dari sumber uap.
2. Pada kromatografi kolom & kromatografi
gas sebelum dan sesudah dipakai harap
dicuci bersih kemudian dikeringkan, lalu
disimpan pada tempat yang aman.
 High Performance Liquid
Chromatography
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi
 -High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High merupakan suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau
Performance padat.

Liquid -Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan

tinggi untuk mengirim fase gerak ke dalam
kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi,
laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan
Chromatography dengan besar metode kromatografi cair yang
digunakan untuk menganalisa zat-zat organik
yang biasanya mempunyai sifat sukar menguap
dan tidak stabil terhadap panas (thermolabil)
High Performance Liquid
Chr omatography

Prinsip kerja HPLC

Pemisahan suatu senyawa kimia dari suatu campuran
atau senyawa lainnya berdasarkan perbedaan sifat
fisiknya.
Memisahkan setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut
(kuantitatif).
 High Performance Liquid
Chr omatography

Kelebihan metode HPLC jika dibandingkan dengan

metode lainnya:
• Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
• Mudah dalam pengoperasian instrumentasinya
• Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan
yang
dianalisis
• Resolusi yang baik
• Dapat digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
• Mudah melakukan "sample recovery"
 High Performance
Liquid Aplikasi HPLC
Chr omatography
1)HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida.
2)Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar
sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi
cair-cair.
3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar
ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4)Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan
rezin Zipax-SAX.
5) Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6) Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan
masalah-masalah biokimia.
High Performance Liquid
Chr omatography

Komponen-komponen HPLC
 High Performance Aplikasi HPLC
Liquid
Chr omatography
Aplikasi dari metode ini digunakan untuk uji anti-angiogenik
menggunakan HPLC untuk mengetahui tingkat kemurnian
dari isolasi dan identifikasi eurycomanone akar pasak bumi
(Eurycoma longifolia, Jack) oleh Salamah et al, (2009)

eurycomanone
 High Performance
Liquid
Chr omatography
200 g serbuk akar pasak bumi

Dimaserasi dng metanol 500 mL, 24 jam, 5 kali

disaring

dievaporasi

Ekstrak metanol

VLC

F1 F2 F3 F4 F5
High Performance
Liquid
Chr omatography
F2

KLT

VLC

Isolat A Isolat B

HPLC

Data Kromatogram
 High Performance
Liquid
Chr omatography

Gambar Hasil elusi HPLC:I. Isolat A, tR= 7,067 II.Pembanding

eurycomanone, tR= 7,108 fase diam silika, fase gerak kloroform : metanol = 4:6
dan kecepatan alir 0,5 mL/menit.
TERIMA KASIH ATAS PERHATIANNYA