KROMATOGRAFI

Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah teknik pemisahan dari suatu
campuran didasarkan atas perbedaan distribusi
komponen tersebut diantara 2 phase yaitu phase
diam dan phase gerak

kromatografi
gas SFC liquid
GSC GLC colomn planar
TLC
PC
LSC
LLC
BPC
IEC
EC
GPC
GFC
Klasifikasi Kromatografi
Berdasarkan fase gerak yang digunakan,
kromatografi dibedakan menjadi dua golongan
besar yaitu gas chromatography dan liquid
chromatography.
Jenis-Jenis Kromatografi
Berdasarkan Teknik Kerja yang
digunakan, antara lain :
1.Kromatografi Kertas
2.Kromatografi Kolom
3.Kromatografi Lapis Tipis
4.Kromatografi Gas
A. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas adalah
kromatografi yang menggunakan kertas
selulosa murni yang mempunyai afinitas
besar terhadap air atau pelarut polar
lainnya.

Kromatografi kertas digunakan untuk
memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya.


fase diam kertas serap

Fase gerak pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai
nilai R
f
. Untuk setiap senyawa berlaku rumus
sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut

A. Kromatografi Kertas
Prinsip Kerja
Kromatografi Kertas
Pelarut bergerak lambat pada
kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda
dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan
bercak warna.

Cara penggunaan
Kromatogarfi kertas
1. Kertas yang digunakan adalah Kertas
Whatman No.1.
2. Sampel diteteskan pada garis dasar
kromatografi kertas.
3. Kertas digantungkan pada wadah yang berisi
pelarut dan terjenuhkan oleh uap pelarut.
4. Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan
penguapan pelarut sama halnya dengan
pergerakan pelarut pada kertas.


Gambar Kromatografi
Kertas
Gambar Kromatografi
Kertas
B. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah
kromatografi yang menggunakan
kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen
dalam campuran.
Prinsip Kerja
Kromatografi Kolom
Didasarkan pada absorbsi komponen2
campuran dengan afinitas berbeda terhadap
permukaan fase diam.
Absorben bertindak sebagai fase diam dan
fase geraknya adalah cairan yang mengalir
membawa komponen campuran sepanjang
kolom.
Sampel yang mempunyai afinitas besar
terhadap absorben akan secara selektif
tertahan dan afinitasnya paling kecil akan
mengikuti aliran pelarut.
Cara Penggunaan
Kromatografi Kolom
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut,
dituangkan melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir
ke dalam adsorben (bahan penyerap).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan
secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita
sempit pada permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi
satu macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung
dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.


Gambar kromatogafi kolom
C. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara
pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang digunakan.

Kromatografi lapis tipis dapat digunakan
untuk memisahkan senyawa senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas.

Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau
alumina yang seragam pada sebuah
lempeng gelas atau logam atau plastik yang
keras.

Fase diam Jel silika (atau alumina) atau
substansi yang dapat berpendarflour dalam
sinar ultra violet.
Fase gerak pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.


Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip kerja Kromatografi
Lapis Tipis
KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika
atau alumina yang seragam pada sebuah
lempeng gelas atau logam atau plastik yang
keras.
Jel silika (atau alumina) merupakan fase
diam.
Fase gerak merupakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.
Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan
warna yang merupakan gabungan dari
beberapa zat pewarna.

Cara Penggunaan
Kromatografi Lapis Tipis
Pada cara penggunaan KLT hampir
sama dengan penggunaan
Kromatografi kertas, hanya saja
pada KLT fase diamnya
menggunakan plat gelas/ logam/
Aluminium foil sedangkan pada
kromatografi kertas menggunakan
kertas saring.

Gambar Kromatografi
Lapis Tipis
Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau
gelas kaca untuk memisahkan
komponen kimia dan bahan
lainnya
Kromatografi Lapis Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar
dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan
pada garis itu.
Ketika bercak dari campuran itu mengering,
lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah
yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.
Menutup gelas kimia untuk meyakinkan
bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan
oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan
kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya
ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam
gelas kimia dengan uap mencegah
penguapan pelarut.


Kromatografi Lapis Tipis (lanjutan)

Perhitungan nilai R
f

Nilai R
f
untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:




Sebagai contoh, jika komponen
berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai R
f

untuk komponen berwarna merah
menjadi:


Analisis Sampel yang Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis
tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana
bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak
berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika
sinar UV diberikan pada lempengan, akan
timbul pendaran dari posisi yang berbeda
dengan posisi bercak-bercak. Bercak
tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Analisis Sampel yang Tidak Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat
bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan
mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh
yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari
campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan
dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan
asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna,
umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali
dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup
(seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji)
bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan
bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih
dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang
dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

D. Kromatografi Gas
Kromatografi gas adalah proses
pemisahan campuran menjadi
komponen- komponennya dengan
menggunakan gas sebagai fase
bergerak yang melewati suatu lapisan
serapan (sorben) yang diam.
Prinsip Kerja
Kromatografi Gas
Gas pembawa (biasanya menggunakan
helium, argon / nitrogen) dengan
tekanan tertentun dialirkan secara
konstan melalui kolom yang berisi
fase diam.
Komponen sampel akan terabsorbsi
oleh fase diam dengan kecepatan
berbeda.
Gambar Kromatografi gas

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi
kimia zat-zat yang tidak diketahui, seperti
senyawa berbeda dalam minyak sawit yang
ditunjukkan oleh tiap-tiap puncak dalam
grafik di bawah ini.
Kromatografi gas
Cara Penggunaan
Kromatografi Gas
1. Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah
diatur.
2. Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh aliran
gas pembawa menuju kolom.
3. Sehingga komponen akan terabsorbsi oleh fase diam
sampai terjadi pemisahan.
4. Komponen yang terpisah menuju detektor akan
menghasilkan sinyal listrik yang besarnya proporsional.
5. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.
6. Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa
puncak.
Cara Memelihara
Kromatografi
1. Pada kromatografi kertas & kromatografi
lapis tipis, fase diam harus disimpan dalam
ruang tertutup atau di tempat yang kering
jauh dari sumber uap.
2. Pada kromatografi kolom & kromatografi gas
sebelum dan sesudah dipakai harap dicuci
bersih kemudian dikeringkan, lalu disimpan
pada tempat yang aman.
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
Peralatan HPLC secara prinsip terdiri dari :
Tempat pelarut
Pompa
Tempat injeksi sampel
Kolom
Detektor
Rekorder

i
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
1. Fasa mobile (pelarut)
pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing untuk
mengeluarkan gas terlarut yang tidak diinginkan.
2. Sistem pompa
ada dua jenis pompa, yang mendasari pemakaiannya yaitu :
tekanan tetap dan volume tetap.
3. Flow controller (pengendali aliran)
untuk menstabilkan aliran fasa mobile akibat adanya perubahan
tekanan gas, temperatur dan viskositas.
4. Kolom
Tidak memerlukan temperatur yang tinggi, karena sifat ikatan
kimia terhadap fasa stasioner sangat sensitif terhadap temperatur
yang tinggi.

High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
5. Detektor
karakteristik detektor untuk HPLC
- sensivitasnya tinggi
- respon yang menyeluruh terhadap sampel
- tidak meruska sampel
- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan
aliran fasa mobile
- dapat beroperasi secara terus menerus.

6. Rekaorder
Mengeluarkan output berupa kromatogram.

Analisa Kualitatif
Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi
suatu senyawa.
Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang
dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang
telah diketahui)
Analisis Kuantitatif
Metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding
dengan kadar senyawa yang membentuk
kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak
didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu
segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah
alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi
segitiga kromatogram tersebut.
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
Metode pengukuran luas puncak
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika
dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas
puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :


Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika
kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain
menggunakan rumus :


Analisis Kuantitatif (lanjutan)
Keuntungan HPLC
Cepat
Resolusi
Sensitivitas detektor
Kolom yang dapat digunakan kembali
Ideal untuk zat bermolekul besar dan
berionik
Mudah rekoveri sampel