KROMATOGRAFI

Pengertian Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan dari suatu

campuran didasarkan atas perbedaan distribusi
komponen tersebut diantara 2 phase yaitu phase
diam dan phase gerak
 Klasifikasi Kromatografi
kromatografi
gas SFC liquid
GSC GLC colomn planar
LSC TLC
LLC PC
BPC
IEC
EC
GPC
GFC
 Jenis-Jenis Kromatografi
• Berdasarkan fase gerak yang digunakan,
kromatografi dibedakan menjadi dua golongan
besar yaitu gas chromatography dan liquid
chromatography.
Jenis-jenis Kromatografi
Berdasarkan Teknik Kerja yang
digunakan, antara lain :
1.Kromatografi Kertas
2.Kromatografi Kolom
3.Kromatografi Lapis Tipis
4.Kromatografi Gas
 A. Kromatografi Kertas

• Kromatografi kertas adalah

kromatografi yang menggunakan kertas
selulosa murni yang mempunyai afinitas
besar terhadap air atau pelarut polar
lainnya.

• Kromatografi kertas digunakan untuk

memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya.
 A. Kromatografi Kertas
fase diam → kertas serap
Fase gerak → pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai

nilai Rf (Retention Factor). Untuk setiap
senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi Kertas

• Retention/retardation factor (Rf) adalah

sebuah nilai atau ukuran yang didapat
berdasarkan posisi noda setiap zat
terlarut pada paper/plat kromatografi
• Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran
dengan afinitas berbeda terhadap permukaan
fase diam.

• Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase

geraknya adalah cairan yang mengalir membawa
komponen campuran sepanjang kolom.
• Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap
absorben akan secara selektif tertahan dan
afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran
pelarut.
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut,
dituangkan melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir
ke dalam adsorben (bahan penyerap).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit
pada permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi
satu macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung
dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar
kolom.
• Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara
pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang digunakan.

• Kromatografi lapis tipis dapat digunakan

untuk memisahkan senyawa – senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas.
• Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau
alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras.

• Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau

substansi yang dapat berpendarflour dalam sinar
ultra violet.
• Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut
yang sesuai.
• KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika atau
alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras.
• Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam.
• Fase gerak merupakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.
• Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan
warna yang merupakan gabungan dari
beberapa zat pewarna.
Pada cara penggunaan KLT hampir sama
dengan penggunaan Kromatografi kertas,
hanya saja pada KLT fase diamnya
menggunakan plat gelas/ logam/ Aluminium
foil sedangkan pada kromatografi kertas
menggunakan kertas saring.
Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau
gelas kaca untuk memisahkan
komponen kimia dan bahan
lainnya
 Kromatografi Lapis Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar
dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan
pada garis itu.
Ketika bercak dari campuran itu mengering,
lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah
yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.
Menutup gelas kimia untuk meyakinkan
bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan
oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan
kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya
ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam
gelas kimia dengan uap mencegah
penguapan pelarut.
Kromatografi Lapis Tipis (lanjutan)
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf
untuk komponen berwarna merah
menjadi:
Analisis Sampel yang Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis

tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana

bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak
berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika
sinar UV diberikan pada lempengan, akan
timbul pendaran dari posisi yang berbeda
dengan posisi bercak-bercak. Bercak
tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Analisis Sampel yang Tidak Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat
bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan
mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh
yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari
campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan

dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan
asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna,
umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali
dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup
(seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji)
bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan

bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih
dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang
dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Kromatografi gas adalah proses
pemisahan campuran menjadi
komponen- komponennya dengan
menggunakan gas sebagai fase
bergerak yang melewati suatu lapisan
serapan (sorben) yang diam.
• Gas pembawa (biasanya menggunakan
helium, argon / nitrogen) dengan
tekanan tertentun dialirkan secara
konstan melalui kolom yang berisi fase
diam.
• Komponen sampel akan terabsorbsi oleh
fase diam dengan kecepatan berbeda.
Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa
berbeda dalam minyak sawit yang ditunjukkan
oleh tiap-tiap puncak dalam grafik di bawah ini.
1. Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah
diatur.
2. Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh aliran
gas pembawa menuju kolom.
3. Sehingga komponen akan terabsorbsi oleh fase diam
sampai terjadi pemisahan.
4. Komponen yang terpisah menuju detektor akan
menghasilkan sinyal listrik yang besarnya proporsional.
5. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.
6. Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa
puncak.
1. Pada kromatografi kertas & kromatografi lapis
tipis, fase diam harus disimpan dalam ruang
tertutup atau di tempat yang kering jauh dari
sumber uap.
2. Pada kromatografi kolom & kromatografi gas
sebelum dan sesudah dipakai harap dicuci
bersih kemudian dikeringkan, lalu disimpan
pada tempat yang aman.
 High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
Peralatan HPLC secara prinsip terdiri dari :
• Tempat pelarut
• Pompa
• Tempat injeksi sampel
• Kolom
• Detektor
• Rekorder
i
 High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
1. Fasa mobile (pelarut)
pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing untuk
mengeluarkan gas terlarut yang tidak diinginkan.
2. Sistem pompa
ada dua jenis pompa, yang mendasari pemakaiannya yaitu :
tekanan tetap dan volume tetap.
3. Flow controller (pengendali aliran)
untuk menstabilkan aliran fasa mobile akibat adanya perubahan
tekanan gas, temperatur dan viskositas.
4. Kolom
Tidak memerlukan temperatur yang tinggi, karena sifat ikatan
kimia terhadap fasa stasioner sangat sensitif terhadap temperatur
yang tinggi.
 High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
5. Detektor
karakteristik detektor untuk HPLC
- sensivitasnya tinggi
- respon yang menyeluruh terhadap sampel
- tidak meruska sampel
- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan
aliran fasa mobile
- dapat beroperasi secara terus menerus.

6. Rekaorder
Mengeluarkan output berupa kromatogram.
 Analisa Kualitatif
• Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi
suatu senyawa.
• Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang
dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang
telah diketahui)
 Analisis Kuantitatif
• Metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding
dengan kadar senyawa yang membentuk
kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak
didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu
segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah
alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi
segitiga kromatogram tersebut.
 Analisis Kuantitatif (lanjutan)
• Metode pengukuran luas puncak
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika
dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas
puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :

Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika

kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain
menggunakan rumus :
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
 Keuntungan HPLC
• Cepat
• Resolusi
• Sensitivitas detektor
• Kolom yang dapat digunakan kembali
• Ideal untuk zat bermolekul besar dan
berionik
• Mudah rekoveri sampel