Oleh :

Qonitah Fardiyah, S.Si.,M.Si

disampaikan pada mata kuliah Kimia Analisis prodi

Teknik Kimia UB

DEFINISI
Kromatografi adalah teknik pemisahan
campuran didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen
campuran tersebut diantara dua fase,
yaitu fase diam (padat atau cair) dan
fase.

Berdasarkan fase gerak yang digunakan,

kromatografi
dibedakan
menjadi
dua
golongan besar yaitu gas chromatography
dan liquid chromatography. Masing-masing
golongan dapat dibagi lagi seperti yang telah
disebutkan pada definisi di atas.

Kromatografi Kolom : Kromatografi

kolom merupakan teknik pemisahan
di mana tempat stasioner dalam
tabung.

Kromatografi Planar
Kromatografi Kertas
Kromatografi Lapisan Tipis

Suatu tetapan tanpa dimensi, K yang

diperoleh dari hukum henry dengan
menggantikan tekanan parsial dan fraksi
mol suatu zat terlarut dengan dua suku
konsentrasi yang sama satuannya.

Adsorpsi

Pertukaran Ion

Partisi Cair - Cair

Adsorpsi adalah proses pemisahan

bahan dari suatu campuran dengan
cara pengikatan bahan tersebut pada
seluruh bagian adsorben cair yang
diikuti dengan pelarutan.

Persyaratan adsorben :
Memiliki daya melarutkan bahan yang akan
diabsorpsi yang sebesar mungkin
(kebutuhan akan cairan lebih sedikit, volume
alat lebih kecil).
Selektif
Memiliki tekanan uap yang rendah
Tidak korosif
Mempunyai viskositas yang rendah
Stabil secara termis
Murah

Untuk memisahkan sejumlah anion dan

kation satu sama lainnya. Anorganik
kation dipisahkan pada kolom resin
pemisah kation, sementara anorganik
anion dipisahkan pada kolom resin
pemisah anion.

Pemisahan ion
Na+, NH4+, K+, Mg2+dan Ca2+

Resin-SO3-H++ Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ Resin-SO3-Na+, NH4+, K+,

Mg2+, Ca2++ H+

Teknik ini tergantung pada partisi zat

padat diantara dua pelarut yang tidak
dapat
bercampur
salah
satu
diantaranya bertindak sebagai fasa
diam dan yang lainnya sebagai fasa
gerak.

Ada dua macam sistem penggunaan dalam kromatografi

cair-cair :
1. Kromatografi fasa normal
fase gerak non polar ( ex: heksana, isopropil-eter)
fase diam sangat polar (ex: air)
digunakan untuk memisahkan senyawa polar, sebab
senyawa polar akan tertahan lebih lama didalam kolom
yang polar, sedangkan senyawa yang non-polar akan
keluar lebih awal dari dalam kolom.

2.

Kromatografi fasa terbalik

fase gerak polar ( ex: air, metanol)
fase diam non polar (ex: hidrokarbon
oktadekana)
digunakan untuk memisahkan
senyawa-senyawa non polar.

Dasarnya adalah waktu retensi atau volume

retensi suatu senyawa.
Membandingkan t atau V senyawa dalam
sampel yang dianalisis dengan t atau V
suatu senyawa standar (yang telah
diketahui)

Metode pengukuran tinggi puncak

Tinggi puncak suatu kromatogram akan
sebanding dengan kadar senyawa yang
membentuk
kromatogram
tersebut.
Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada
rumus pengukuran tinggi suatu segitiga, yaitu
suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas
kromatogram sampai dengan perpotongan
sisi segitiga kromatogram tersebut.

Metode pengukuran luas puncak

Dapat memberikan hasil yang lebih akurat
jika dibandingkan dengan cara pengukuran
tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti
menghitung luas segitiga yaitu :
Rumus tersebut memberikan hasil yang baik
jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara
lain menggunakan rumus :

Metode gunting dan timbang

Kromatogram yang telah digambarkan pada
kertas
digunting
sesuai
bentuknya,
kemudian
guntingan-guntingan
kertas
kromatogram ini ditimbang. Berat dari
masing-masing guntingan kromatogram ini
akan sebanding dengan kadar senyawa
yang membentuk kromatogram tersebut.

Metode Integrator
Integrator adalah peralatan elektronik yang
sering dijumpai pada peralatan kromatografi
yang modern. Alat ini akan mengubah tandatanda listrik dari detektor menjadi suatu
gambaran
kromatogram
sekaligus
menghitung
luas
kromatogram
yang
dibentuk secara elektronik.

fase diam kertas serap

Fase gerak pelarut atau campuran pelarut
yang sesuai
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai
Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus
sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau

alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras
Fase diam Jel silika (atau alumina) atau
substansi yang dapat berpendarflour dalam sinar
ultra violet.
Fase gerak pelarut atau campuran pelarut
yang sesuai

1. Sebuah garis menggunakan pinsil digambar

dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan
pada garis itu.
2. Ketika bercak dari campuran itu mengering,
lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah
yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.
3. Menutup gelas kimia untuk meyakinkan
bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan
oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan
kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya
ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam
gelas kimia dengan uap mencegah penguapan
pelarut.

Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna
dihitung dengan rumus
sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika

komponen berwarna merah
bergerak dari 1.7 cm dari
garis awal, sementara
pelarut berjarak 5.0 cm,
sehingga nilai Rf untuk
komponen berwarna merah
menjadi:

1. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan
lapis tipis seringkali memiliki substansi
yang ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV).
Pendaran ini ditutupi pada posisi
dimana bercak pada kromatogram
berada, meskipun bercak-bercak itu
tidak tampak berwarna jika dilihat
dengan mata. Ketika sinar UV diberikan
pada lempengan, akan timbul pendaran
dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai
bidang kecil yang gelap.

2. Penunjukkan bercak secara

kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk
membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan
jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah
contoh yang baik adalah kromatogram yang
dihasilkan dari campuran asam amino.
Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan
dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi
dengan asam amino menghasilkan senyawasenyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan
kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah
bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan
gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan
bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan
lebih dekat pada bercak daripada lempengan.
Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercakbercak kecoklatan.

Kolom kromatografi
bekerja
berdasarkan skala
yang lebih besar
menggunakan
material
terpadatkan pada
sebuah kolom
gelas vertikal.

Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa

yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran
yang tampak adalah hijau.
Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan
pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering
sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas,
dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari
bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga
campuran berwarna akan diserap pada bagian atas
material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti
gambar disamping.
menamambahkan pelarut baru melalui bagian atas
kolom, jangan sampai merusak material terpadatkan
dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat
mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas
kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut
mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru
dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah
kering.

Bergerak / aliran karena gaya grafitasi

Pemilihan fase diam + fase gerak

Kepolaran

Pita-pita kromatogram

Terbentuk fraksi-fraksi

Dianalisis dengan KLT / KK

Mikhail Tswett

Pigmen tumbuhan

Pita-pita

Fase diam
Pasir

fase diam homogen

fase diam ukuran sama
fase diam bentuk seragam
bebas gelembung udara

Kapas / glass
wool

Teknis : fase diam + pelarut bubur (fase gerak)

Isolasi hasil fraksi dengan KLT

Preparatif
CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4

Isolat yang diambil

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT

CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4

A: isolat hasil isolasi I

B: isolat hasil isolasi II

Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm.

fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Contoh:

44

Umum
1. K. Cair
(LC)
2. K. Gas
(GC)

Tehnik
Spesifik

Fase diam

Keseimban
gan

LLC
LSC
IEC

Cair pd padatan
Padatan
Resin

Partisi
Adsorbsi
Tukar ion

GLC
GSC
Gas terikat

Cair pd padatan
Padatan
Padatan

Partisi
Adsorbsi
P/A

Kromatografi
Fase diam

Stationary phase

fase gerak

mobile phase

Pemisahan

Perbedaan laju migrasi

Polaritas senyawa

Secara ideal : CS & CM

kurva linier
CS

Macam-macam bentuk
kesetimbangan CS & CM
CS

CM

Kurva A

: ideal tidak saling campur

kromatografi Linier
B/C : ada asosiasi & desosiasi
D : ada reaksi isoterm adsorpsi

D
A
C

CM

Kromatografi cenderung kurva A konsentrasi relatif rendah

Solvent
E
B+E
E

kolom

Sp

A+ E
E

signal

tR

Elusi : proses terbawanya

komponen dlm suatu camp,
shg ada pemisahan
komponen yg dibawa oleh FG
dari ujung atas kolom
bawah
tR : waktu yg diperlukan oleh
komponen untuk bermigrasi
sepanjang kolom
Vr : volume FG yg
dibutuhkan untuk membawa
komponen dari titik awal
kolom akhir kolom

F : laju alir FG yang menyatakan jumlah vol FG per

satuan waktu

F = VR / t R
tR = V R / F
Dalam kolom yang ideal

Komp. yang tidak teretensi

t=0

Komp. di atas memerlukan waktu untuk bermigrasi

tM : waktu FG melewati kolom
VM : fraksi volum kolom yang dilalui komponen

tR = t R t M
VR = VR VM terkoreksi

Untuk menerangkan proses pemisahan dlm kromatografi ada

2 macam teori :
Teori Lempeng (Plate Theory)

Martin & Synge (1941)

Efisiensi kolom

Apabila jumlah kesetimbangan makin besar

efisiensi >> menambah jumlah lempeng (N)
tebal lempeng teoritik H
N & H menyatakan efisiensi

Secara matematis : N = L / H
Kelemahan teori :
1.

tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yang

mempengaruhi pelebaran pita kromatogram

2. Teori Kinetik ( Kinetics Theory)

Dapat mengatasi kelemahan teori Plate.

teori laju / rate theory

Partikel komponen bermigrasi diantara FG & FD

Migrasi sangat tidak teratur

Energi thermal

Gerakan partikelnya random

Ditribusi simetrik Gauss

H.E.T.P
H = 16 L x (Wb / tR)2
N = 16 x (tR / Wb)2 = (4tR/W)2
Simetrik Gauss t (waktu) lama puncak lebar

Menurut Van Deemter

Ada 3 proses secara stimultan yg mempengaruhi variabilitas laju

migrasi komponen diantara FG & FD :
Difusi Eddy (Eddy diffusion)
2.
Difusi longitudinal (longitudinal diffusion)
3.
Proses transfer massa

Pada tebal lempeng teoritik (H) merupakan fungsi linier

variabilitas laju migrasi komponen

1.

Persamaan Van Deemter

H = A + B / + C.

A = koefisien Difusi Eddy

B = koefisien Difusi longitudinal
C = (CS + CM) = koefisien total

Difussi longitudinal

Pelebaran pita

Molekul komponen dlm FG bermigrasi dari konsentrasi

tinggi ke konsentrasi rendah

Kontribusi variabilitas laju migrasi yg menurun secara

hiperbolik terhadap kenaikan kecepatan linier FG ()

Pada tebal lempeng teoritik

HLD =

2DM

DM = koefisien difusi komponen FG

= kualitas packing FD

0,6

Pelebaran pita Transfer Massa

Konstribusi H akan naik apabila kec. Linier FG naik

Makin cepat kec. FG akan makin singkat proses

transfer massa pemisahan rendah

Pelebaran pita diffuse Eddy

Akibat tidak homogen pori dalam packing kolom

Ada yang jalannya pendek dan ada yang panjang

Composite curve
C standar

H. Opt

C mobile

H min
A

Proses migrasi

H = A + B / + C. Persamaan Van Deemter

Sinyal analitik

tA

tM

0
W

t (waktu)

konsentrasi

Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalami retensi &

tidak

B
Jarak migrasi

Profil konsentrasi komp. A & B dalam kolom pada

jarak migrasi yang berbeda

Mempengaruhi kualitas kolom

1. Waktu Retensi
V=

tR
tM

Laju migrasi komponen

2. Faktor-faktor kapasitas kolom (k)

Ratio jumlah molekul komponen dalam FD
terhadap jumlah molekul komponen dalam
FG

nS
[ CS x VS ]
k =
=
nM
[ C M x VM ]
VS
k =
xk
VM
k =

( t R t M)
tM

tR
tM

Pengalaman : k < 1

Tidak memisah
Disarankan : k semakin besar

Pemisahan

k > 10

Tidak ekonomis

3. Faktor selektivitas ()

Ratio koef. Distribusi 2 komponen yang akan

dipisahkan

Menggambarkan kemampuan pemisahan suatu kolom

= KB / KA

KB / KA = koef. Distribusi komp. B / A

Dimana : KB = koef. Distribusi komponen B yg teretensi
kuat dalam kolom
KA = koef. Distribusi komponen A yg teretensi
lemah dalam kolom

Ada hubungan dengan k

= KB / KA

(tR)B - tM
=
(tR)A - tM

4. Resolusi Kolom (Rs)

RS=

RS=

Z
0,5WA + 0,5WB

2 Z
( WA + WB )

2 [ (tR)B (tR)A ]
WA + W B

Z = jarak puncak A & puncak B

WA = lebar dasar kromatogram A
WB = lebar dasar kromatogram B

Disarankan RS 1,5

Hubungan dengan faktor-faktor lain

VN ( 1)
kB
RS =
x
x

( 1 + kB )
4

Berikut adalah data yang diperoleh untuk 3 buah senyawa yang

dipisahkan menggunakan kolom sepanjang 20 meter
Senyawa
tR (menit)
W (menit)
A
8,04
0,15
B
8,26
0,15
C
8,43
0,16
a.
Hitunglah plat teoritik untuk masing-masing senyawa dan jumlah rata2
plat teoritik
b.
Hitunglah tinggi rata2plat teoritiknya
c.
Jelaskan mengapa masing2 senyawa memiliki jumlah plat teoritik yang
berbeda
d.
Hitung resolusi dan selektivitasnya untuk tiap pasangan yang mungkin
dari data di atas. Waktu retensi solut yang tidak teretensi oleh fasa diam
adalah 1,19 menit
1.

2. Dilakukan analisis 4 buah senyawa

trihalometan, yaitu CHCl3, CHBr3, CHCl2Br,
CHClBr2 menggunakan packing kolom
packing dengan fasa diam non polar.
Prediksikan urutan elusi dari keempat
senyawa tersebut !
3. Pada analisis senyawa trihalometan pada air
minum diperoleh standar tunggal sbb :
Senyawa CHCl3 : kons 1,30 ppb; luas puncak
1,35 x 104 Hitung konsentrasi senyawa
tersebut jika diperoleh luas puncak 1,56 x 10 4

dikerjakan di kertas folio bergaris

dikumpulkan hari ini di loker
Dikerjakan secara individu