ABSORBSI OBAT PER ORAL

SECARA IN VITRO

Kelompok A2-1 :

1. Fasya Nadhira Sariful (172210101030)

2. Talidah Alqibtiyah Roja (172210101141)
3. Ayu Mega Lestari (172210101142)
4. Amanda Della Yudatama (182210101008)
5. Karisa Erisna Sitorus (182210101009)
TUJUAN PERCOBAAN

Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa dapat memahami

pengaruh pH terhadap absorpsi obat melalui saluran
pencernaan secara in vitro.
Teori Dasar

Absorbsi obat adalah suatu proses pergerakan obat yang sudah terlarut dari tempat
pemberian ke dalam sirkulasi darah melalui membran pada tempat pemberian obat.
Mekanisme absorpsi terdiri dari tiga macam yaitu (1) difusi pasif, (2) transport menggunakan
protein yang dapat berupa saluran (channel), difusi terfasilitasi oleh pembawa (carrier) dan
transport aktif oleh sistem pompa (pumps). Sebagian besar obat melalui meknisme difusi
pasif, serta (3) pinositosis dan endositosis
Absorpsi atau penyerapan zat aktif adalah masuknya molekul-molekul obat ke dalam
tubuh atau menuju ke peredaran darah tubuh setelah melewati sawar biologic. Absorpsi obat
adalah peran yang terpenting untuk akhirnya menentukan efektivitas obat (Joenoes, 2002).
Sebelum obat diabsorpsi, terlebih dahulu obat itu larut dalam cairan biologis. Kelarutan serta
cepat-lambatnya melarut menentukan banyaknya obat terabsorpsi. Dalam hal pemberian
obat per oral, cairan biologis utama adalah cairan gastrointestinal, dari sini melalui membrane
biologis obat masuk keperedaran sistemik (Joenoes, 2002).
Derajat ionisasi tergantung pada pH larutan dan pKa
obat seperti terlihat pada persamaan Henderson-
Hasselbalch sebagai berikut :
𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡
 Untuk suatu asam : pH = pKa + log
𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡
𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡
 Untuk suatu basa : pH = pKa - log
𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡

 dengan menyusun kembali persamaan untuk asam :

𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡
 log = pKa-pH
𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦𝑦 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡
 Maka secara teoritis dapat ditentukan jumlah relatif dari suatu obat
dalam bentuk tidak terionkan pada berbagai kondisi pH. Untuk obat
yang ditranspor secara difusi pasif, peranan dinding usus hanya
sebagai membran difusi
 Faktor Yang Mempengaruhi Absorbsi
Obat Oral
 Anatomi dan fisiologi tempat absorbs obat
- Faktor fisiologi
- Fisiologi gastrointestinal ; kecepatan pengosongan lambung, motilitas usus, pengaruh
makanan
- Anatomi lambung dan usus
 Faktor fisika kimia obat
- Kelarutan >> Semakin cepat larut semakin mudah diabsorpsi
- Log P >> semain besar log P semakin lipofil
- Ukuran partikel >> semakin kecil ukuran partikel semakin besar luas permukaan semakin
cepat diabsorbsi
- pKa >> menentukan bentuk molekulnya terionisasi atau tidak terionisasi
 Faktor yang Mempengaruhi Penyerapan
Obat Tidak Sempurna
 Disolusi yang terbatas
Ketersediaan suatu obat sangat bergantung pada kemampuan zat tersebut melarut ke dalam
media pelarut sebelum diserap oleh tubuh. Semakin kecil zat aktif yang terlepas, maka
penyerapan obat oleh tubuh juga dalam jumlah kecil.
 Degradasi , presipitasi dan kompleksasi obat di saluran cerna
Degradasi, presipitasi, dan kompleksasi obat akan menyebabkan obat tertahan dalam cairan
gastrointestinal
 Permeasi terbatas pada mukosa gastrointestinal
Fungsi dari pembatasan oleh mukosa gastrointestinal adalah melindungi tubuh dari
xenobiotik
 Mukosa Gastrointestinak

 Saluran pencernaan dilapisi oleh selaput lendir (mukosa). Mukosa terdiri atas sel
epitel yang dilapisi dengan mukus dan didukung dengan adanya jaringan ikat
longgar (lamina propia) yang mengandung darah, kapiler limfatik, serta lapisan
tipis sel otot polos (muscularis mucosae).
 Luas permukaan mukosa mengalami peningkatan dengan adanya modifikasi
seperti lipatan, vill (finger-like projections) dan mikrovili (pada membrane sel
apikal enterosit). Usus halus lebih besar dibandingkan lambung dan usus besar.
Hal ini juga menunjukkan bahwa penyerapan pada usus halus umumnya lebih
besar.
Mukosa Gastrointestinal sebagai Penghalang
untuk Permeasi Obat
 Penghalang fisika
Untuk mencapai peredaran darah, obat-obatan yang terlarut harus melewati
penghalang fisik yaitu lapisan lendir dan monolayer usus dari enterosit. Lapisan
lendir yang dihasilkan oleh sel gobet bersifat hidrofilik, sehingga dapat mebatasi
proses difusi obat yang bersifat lipofilik kuat (log p >3) yang berakibat pada
penurunan permeabilitas obat.
 Penghalang biokimia
Yang berperan dalam penghalang biokimia adalah adanya proses metabolism usus.
Selain microflora usus, enzim juga berperan dalam proses metabolism usus. Hal lain
yang berperan dalam penghalang biokimia ini adalah efflux usus juga dapat
mempengaruhi penyerapan berbagai senyawa pada lumen usus (Jennifer, 2009).
 Pengukuran Permeabilitas

 Penilaian permeabilitas sangat penting dalam pemilihan obat yang dimaksudkan untuk
pemberian oral dan untuk meningkatkan proses penyerapan obat. Hal ini dapat tercermin
dalam sistem klasifikasi biofarmasi (BCS), dimana permeabilitas adalah parameter paling
penting untuk mengklasifikasikan obat sesuai dengan sifat biofarmasetikanya.

 Pada dasarnya, terdapat perbedaan dalam cara simulasi penghalang gastrointestinal,

yaitu terdapat membrane buatan, lapisan sel yang dikultur, atau jaringan usus nyata.
Secara umum bentuk obat tak terion lebih larut dalam lemak daripada dengan bentuk
terion. Derajat ionisasi tergantung pada pH larutan dan pKa obat.
 Metode Usus Terbalik (Everted Intestinal
Rings/ Sacs)
 Metode usus terbalik merupakan metode yang relatif sederhana untuk pengukuran
absorbsi. Pada metode ini, bagian usus segera diisolasi setelah hewan ditidurkan.
Kemudian usus dicuci dalam buffer dingin untuk menghilangkan kotoran dan produk
pencernaan. Salah satu ujung potongan usus diikat dengan sepotong jahitan dan ujung
yang tertutup didorong dengan hati-hati menggunakan batang kaca dan menghasilkan
segmen usus dalam-luar. Untuk mendapatkan cincin usus, jaringan dipotong menjadi
cincin sebesar 2-4 mm.
 Cincin-cincin tersebut diinkubasi dalam larutan buffer beroksigen karbogen yang
mengandung senyawa yang diteliti dan dikocok dalam bak air. Setelah interval waktu
yang telah ditentukan, cincin diambil dari larutan, dikeringkan, ditimbang, dan
dilarutkan/ diproses untuk analisis. Penyerapan senyawa dapat diukur dengan
penghitungan radiolabel/ uji fluorosensi.
 Asam Salisilat

Asetosal (asam asetil salisilat) dikenal dengan nama dagang Aspirin, merupakan
obat pereda nyeri golongan 'anti radang non steroid' (AINS), sering digunakan
untuk mengatasi nyeri reumatik, pereda nyeri (analgesik), dan penurun demam
(antipiretik).
Pada pemberian oral, sebagian salisilat diabsorpsi dengan daya absorpsi 70%
dalam bentuk utuh dalam lambung, tetapi sebagian besar absorpsi terjadi dalam
usus halus bagian atas. Sebagian asam salisilat dihidrolisis kemudian
didistribusikan ke seluruh tubuh dan segera menyebar ke seluruh tubuh dan
cairan transeluler setelah diabsorpsi.
Kecepatan absorpsi tergantung dari kecepatan disintegrasi dan disolusi tablet,
pH, permukaan mukosa, dan waktu pengosongan lambung. Salisilat dapat
ditemukan dalam cairan sinovial, cairan spinal, liur, dan air susu. Kadar tertinggi
dapat tercapai kira-kira 2 jam setelah pemberian.
 Asam salisilat memiliki efek analgesik tetapi jarang digunakan oral karena
toksisitasnya relatif tinggi, sehingga yang sering digunakan adalah senyawa
turunannya. Tujuan modifikasi asam salisilat adalah untuk meningkatkan efek
analgetik dan mengurangi efek toksik.
 Asam salisilat memiliki efek samping berupa iritasi mukosa lambung dengan
resiko tukak lambung dan perdarahan. Jika digunakan dalam dosis besar dapat
menyebabkan iritasi mukosa lambung karena hilangnya efek perlindungan
prostaglandin terhadap mukosa lambung yang sintesisnya dihalangi oleh
blockade COX.
 Petunjuk Umum

Lakukan percobaan absorpsi obat (asam salisilat) per oral secara in vitro menggunakan alat Tabung
Crane and Wilson yang telah dimodifikasi yang di dalamnya terpasang usus tikus yang sudah dibalik

Percobaan dilakukan dalam 2 (dua) kondisi pH cairan mukosal yang berbeda yaitu menggunakan cairan
lambung buatan (CLB) yang mempunyai pH 1,2 dan cairan usus buatan (CUB) yang mempunyai pH 6,8
ALAT DAN BAHAN
Alat Bahan
- Tabung Crane and Wilson (yang telah - Cairan Lambung Buatan tanpa pepsin pH
dimodifikasi) 1,2 (CLB)
- Water bath - Cairan Usus Buatan tanpa pankreatin pH
6,8 (CUB)
- Tabung gas oksigen
- Larutan NaCl 0,9% b/v
- Selang silicon
- Asam salisilat
- Spektrofotometer UV-VIS
- Eter
- Kuvet
- Gas oksigen
- pH meter
- Alkohol
- Timbangan analitik
- Seng sulfat
- Peralatan bedah
- Barium hidroksida
- Alat-alat gelas lain yang biasa digunakan di
laboratorium Hewan
- Tikus putih jantan putih
 PETUNJUK KHUSUS
a. Pembuatan cairan mukosal

Dibuat 2 macam cairan mukosal yaitu CLB dan CUB tanpa enzim sebanyak 1 L

Dibuat larutan CUB dengan melarutkan 6,8 g kalium fosfat monobasa P dalam
500 mL air. Aduk hingga homogen.

Ditambahkan 77 mL Natrium Hidroksida 0,2 N dan 500 mL air, dicampurkan

dan diatur pH hingga 6,8 ± 0,1 dengan penambahan natrum hidroksida 0,2 N
atau asam klorida 0,2 N. Lalu diencerkan dengan air ad 100 mL.

Dibuat larutan CLB tanpa enzim dengan melarutkan 2 g natrium klorida P dalam
7 mL HCL dan ditambahkan air ad 1000 mL.

Diatur pH larutan CLB ± 1,2 disesuaikan dengan pH lambung.

Dilarutkan 500 mg asam salisilat dalam larutan CLB dan CUB tanpa enzim
masing-masing 100 mL
b. Pembuatan Cairan Serosal

Cairan serosal dipresentasikan oleh larutan NaCl 0,9% (b/v) yang isotonis
dengan cairan darah.

Cara 1 : Ditimbang 0,9 g Natrium klorida (NaCl) dan dilarutkan dengan

aquades ad 100 mL.

Cara 2 : Cairan serosal dapat langsung menggunakan cairan infus.

c. Pembuatan Kurva Baku Asam Salisilat dalam NaCl 0,9%

Dibuat kurva baku asam salisilat dalam NaCl 0,9% dengan konsentrasi 5
ppm, 10 ppm, 15 ppm, 30 ppm dan 40 ppm.

Tentukan dua persamaan kurva kalibrasi yang didapat dari y = bx + a

d. Penyiapan Usus Halus Tikus Bagian Ileum yang Dibalik

Digunakan tikus putih jantan.

Tikus dipuasakan selama 20 - 24 jam dengan tetap memberinya minum.

Tikus dibunuh dengan menggunakan eter atau dengan cara lain.

Dibedah perut tikus di sepanjang linea mediana dan keluarkan usus halus.

Dibuang usus tikus sepanjang 15 cm di bawah pylorus dan gunaan usus tikus sepanjang
20 cm di bawahnya untuk percobaan.

Usus dibagi menjadi 2 bagian sama panjang. Kemudian dibersihkan.

Ujung kanal dan potongan usus tersebut diikat dengan benang, kemudian dengan batang
gelas yang berdiameter 22 mm dibalikkan usus tikus, sehingga bagian dalam (mukosa)
menjadi di luar dan bagian luar menjadi di dalam.

Usus tikus yang telah dibalik kemudian direndam dalam larutan NaCl 0,9% sebelum
digunakan.
e. Percobaan Absorbsi Obat

Waterbath diisi dengan menggunakan air kran dan diatur alat pada suhu 37oC

Digunakan 2 tabung Crane dan Wilson, diatur jarak pipa pendek dan panjang sebesar 15
cm.

Dipasang dua usus tikus yang telah dibalik pada kanula bagian tengah dari masing-
masing 2 tabung.

Diikat masing-masing kedua ujung usus tikus dengan hati-hati jangan sampai usus putus
atau bocor.

Dimasukkan cairan serosal ke dalam kanula tengah dan pastikan cairan serosal masuk
ke dalam usus dan pastikan usus tidak bocor dan dicatat volume cairan serosal yang bisa
masuk.

Setelah dipastikan cairan serosal masuk dan usus tidak bocor, diletakkan kanula pada
tabung Crane and Wilson yang sebelumnya telah diisi cairan mukosal yaitu CUB dan
CLB yang mengandung asam salisilat sebanyak 100 mL dan telah terbasang di
waterbath yang bersuhu 37oC
Dialiri kanula pinggir dengan oksigen melalui selang silicon. Atur kecepatang
gelembung agar sama antara tabung 1 dan 2 (100 gelembung/menit).

Dipantau usus agar selama percobaan terendam cairan mukosal.

Diambil sampel dar kanula tengah (cairan serosal) sebanyak 1,5 mL pada
menit ke 5, 10, 20 dan 30.

Disetiap pengambilan sampel, ganti cairan serosal dengan jumlah volume

yang sama (1,5 mL).

Dipiper sebanyak 1,0 mL sampel dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

Sampel kemudian dita]mbah dengan 2 mL larutan sengsulfat 5% dan 2 mL

barium hidroksida 0,3 N. Larutan dikocok dan disentrifuge selama 5 menit.

Bagian yang jernih diukur absorban sampel pada panjang gelombang

maksimum.
 Dicatat hasil percobaan mengikuti format tabel hasil percobaan absorbsi asam
salisilat per oral secara in vitro.

Dibuat grafik hubungan Qb/cm2 (luas area usus) (sumbu Y) terhadap waktu
(sumbu X) untuk kedua kondisi percobaan dalam satu grafik sehingga didapat
dua garis. (Hitung jari-jari usus dan panjang usus sebagai data untuk menghitung
luas area usus).

Dari persamaan yang didapat, dihitung :

a. Tetapan absorbsi (K) --> (Tetapan absorpsi adalah nilai B dari persamaan)
b. Tetapan permeabilitas (Pm) --> ( Pm = B/konsentrasi asam salisilat dalam
cairan mukosal)
c. Lag time (X) untuk kedua kondisi percobaan dengan memasukkan nilai Y = 0

Dicatat hasil perhitungan mengikuti format tabel rekap hasil perhitungan absorpsi
dari percobaan.
 TUGAS PENDAHULUAN

Hitung penimbangan dan pengenceran • 30 ppm ;

30 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
=
1000 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 200 𝑚𝑚𝑚𝑚
untuk pembuatan kurva baku asam
salisilat dalam NaCl dengan rentang x = 6 mL
konsentrasi 5-40 ppm ! 20 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 1000 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
• 20 ppm ; =
𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 200 𝑚𝑚𝑚𝑚
− Penimbangan
x = 4 mL
𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 15 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 1000 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
• 1000 ppm = 𝑥𝑥 1000 • 15 ppm ; =
200 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 200 𝑚𝑚𝑚𝑚
x = 200 mg
x = 3 mL
− Pengenceran 10 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 1000 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
• 10 ppm ; =
𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 200 𝑚𝑚𝑚𝑚

• 40 ppm ;
40 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
=
1000 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 x = 2 mL
𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 200 𝑚𝑚𝑚𝑚
5 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 1000 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
x = 8 mL • 5 ppm ; =
𝑥𝑥 𝑚𝑚𝑚𝑚 200 𝑚𝑚𝑚𝑚
x = 1 mL
TERIMA KASIH