KHROMATOGRAFI

Kromatografi
DEFINISI


Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran

didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-
komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu
fase diam (padat atau cair) dan fase gerak
Pertama kali digunakan oleh seorang ahli botani bernama
Tswett pada tahun 1906, cara terbaik memisahkan
komponen-komponen berwarna dari tumbuhan. Caranya
memasukkan komponen berwarna dalam kolom gelas,
kemudian dialirkan pelarut organic dengan kecepatan alir
tertentu, dan eluat ditampung dalam beaker gelas.
Lanjut….
 Eluat yang diperoleh berwarna-warna, disebabkan oleh
kemampuan zat teradsorpsi berbeda-beda oleh pelarut.
Karena memberikan warna yang berbeda disebutlah
“khromatografi” dalam Bahasa Yunani khromatos artinya
warna dan graphos artinya yang tertulis.
 Lapisan-lapisan berwarna ini dapat dipisahkan dengan
cara ekstraksi,
 Cara ini berkembanga terus, tidak terbatas pada senyawa
berwarna saja, tapi juga untuk pemisahan komponen-
komponen senyawa yang berguna untuk isolasi/ menguji
kemunian dan untuk Analisa kualitatif dan kuantitatif
Teknik Khromatografi
 Adalah Teknik pemisahan suatu campuran yang
bergantung pada perbedaan migrasi dari masing-masing
komponen campuran melalui suatu fasa stationer (diam)
dibawah pengaruh suatu pelarut yang bergerak yaitu fasa
mobil
 Mekanisme yang terjadi pada fasa diam adalah
 - mekanisme adsorbsi
 - mekanisme partisi
 - mekanisme penukar ion
 - mekanisme penyaringan molekul
Klasifikasi Khromatografi
 1. Khromatografi Kolom
 - khromatografi kolom biasa
 - khromatografi gas (GC)
 - Khromatografi Cair Tekanan Tinggi (HPLC)
 2. Khromatografi kertas
 3. Khromatografi Lapisan Tipis (TLC)
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi pigmen
tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas
kaca untuk memisahkan komponen
kimia dan bahan lainnya

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa
berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh
tiap-tiap puncak dalam grafik di bawah ini.
Paper Chromatography
Dapat digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen
tinta, pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat
lain
Proses Kromatografi

 Pembawa gas
 Detektor
 Kolom
 Flow Controller
 Sampel Injeksi

 INSTRUMENTASI KHROMATOGRAFI KOLOM

 ( gambar)
Gas pembawa
 Gas yang telah digunakan dalam GLC : Hidrogen,
helium, nitrogen, argon, karbon dioksida, dan uap air.
 Gas pembawa yang cocok bergantung pada karakteristik
detektor tersebut.
 Gas hidrogen dan helium digunakan pada detektor
kinduktivitas termal sedangkan nitrogen digunakan pada
detektor pengionan nyala.
Sistem pengambilan sampel
 Sampel-sampel cair : diinjeksikan melalui suatu karet
septum dengan memakai suntikan syringe.
 Sampel-sampel gas : diinjeksikan atau dimasukkan
dengan memakai bermacam-macam alat pengambilan
sampel gas yang dirancang untuk kromatograf komersial
kolom
 Kolom Kapiler
- Merupakan tabung yang panjang dan tipis dari kaca atau
bahan lainnya seperti baja tahan karat.
- Hanya dapat menangani sampel-sampel yang sangat kecil,
dan penggunaannya secara luas menunggu pengembangan
detektor yang sangat sensitif.
 Kolom Isian
Fasa stasioner dalam GLC adalah cairan, tetapi cairan itu tidak
boleh dibiarkan bergerak-gerak di dalam tabung. Cairan
tersebut harus diimobilisasi, biasanya dalam bentuk suatu
lapisan tipis dengan luas permukaan besar. Ini paling lazim
dilakukan dengan mengimpregnasi suatu bahan padat dengan
fase cair kolom diisi.
Kolom … (2)
 Pemilihan fasa cair
- Fasa cair stasioner harus dipilih dengan
mempertimbangkan masalah pemisahan tertentu.
- Fasa cair harus stabil secara termal pada temperatur
kolom (kecuali dalam kasus-kasus khusus), tidak bereaksi
secara kimia dengan komponen-komponen sampel,
memiliki daya pelarut yang cukup untuk sampel.
PROSES-PROSES DISTRIBUSI FASA

 Adsorpsi

 Pertukaran Ion

 Partisi Cair - Cair

ADSORBEN
Persyaratan adsorben :
 Memiliki daya melarutkan bahan yang akan diabsorpsi
yang sebesar mungkin (kebutuhan akan cairan lebih
sedikit, volume alat lebih kecil).
 Selektif
 Memiliki tekanan uap yang rendah
 Tidak korosif
 Mempunyai viskositas yang rendah
 Stabil secara termis
 Murah
Prinsip Pemisahan Ion
Untuk memisahkan sejumlah anion dan kation satu sama
lainnya. Anorganik kation dipisahkan pada kolom resin
pemisah kation, sementara anorganik anion dipisahkan
pada kolom resin pemisah anion.
Resin Pemisah Ion
Contoh
Pemisahan ion
Na+, NH4+, K+, Mg2+ dan Ca2+

Resin-SO3-H+ + Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ ↔ Resin-SO3-Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ +
H+
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
 Metode pengukuran luas puncak
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan
dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur
seperti menghitung luas segitiga yaitu :

Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika

kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan
rumus :
Kromatografi Kertas
fase diam → kertas serap

Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk

setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi Kertas (lanjutan)
Kromatografi Kertas Dua Arah
 Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.

 Menggunakan dua pelarut yang berbeda

Kromatografi Lapis Tipis
 Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau
plastik yang keras.

 Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau substansi yang

dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet.
 Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna
ditempatkan pada garis itu.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut
dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi
bercak berada.

Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah kondisi dalam

gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk
mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya
ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh
pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf
untuk komponen berwarna merah
menjadi:
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis

seringkali memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran
flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak

pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat
dengan mata. Ketika sinar UV diberikan pada
lempengan, akan timbul pendaran dari posisi
yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak

menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan

ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-
senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan
gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram,
atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan.
Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
 Kromatografi Kolom

Kolom kromatografi
berkerja berdasarkan skala
yang lebih besar
menggunakan material
terpadatkan pada sebuah
kolom gelas vertikal.
Penggunaan kolom
Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna,
yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau.
Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang
sudah berada dalam kolom mengering sehingga material
terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan
larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran
kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian
atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar
disamping.

menamambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, jangan

sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran,
supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam
satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir
kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas
kolom sehingga kolom tidak pernah kering.
Perubahan yang mungkin terjadi sejalan perubahan waktu