KIS2101 Praktikum Kimia Organik Semester Gasal 2017/2018 Modul 6

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DAN KROMATOGRAFI KOLOM

Pemisahan Pigmen Tanaman

I. Latar Belakang
Kromatografi merupakan metoda pemisahan dan pemurnian senyawa organik yang efektif dan
sangat berguna dan dapat digunakan untuk campuran kompleks. Kromatografi berasal dari Bahasa
Yunani; khromatos yang artinya warna dan graphos yang artinya menulis. Tehnik kromatografi
ditemukan oleh Mikhail Tswett pada tahun 1906.

Metoda pemisahan pada kromatografi didasarkan pada distribusi senyawa-senyawa dalam

campuran antara fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase). Fasa diam dapat
berupa kolom adsorben kertas, adsorben lapis tipis pada pelat kaca dan sebagainya, dimana fasa
gerak berjalan. Fasa gerak dapat berupa cairan atau gas. Jika fasa diam adalah adsorben kolom
maka disebut sebagai kromatografi kolom, jika fasa diam yang digunakan adalah kertas disebut
kromatografi kertas, dan jika fasa diam yang digunakan adsorben lapis tipis disebut kromatografi
lapis tipis (Thin Layer Cromatography atau disingkat dengan TLC).

Fasa diam merupakan bahan yang solid, inert yang mengandung gugus fungsi polar sehingga
senyawa polar akan memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fasa diam. Karena pemilkihan
fasa diam [ada umunya terbatas, makan variasi banyak dilakukan pada fasa gerak atau seyawa
organik yang digunakan. Fasa gerak atau pelarut yang baik bergantung pada campuarn senyawa yang
dipisahkan dan dapat merupakan campuran pelarut yang berbeda kepolarannya (contoh: heksana dan
etanol). Fasa gerak yang baik pada umumnya ditentukan dengan percobaan menggunakan TLC.

Pada percobaan ini akan dilakukan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom untuk
pemisahan pigmen tanaman.

1.1. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis pada umumnya terdiri dari empat tahap proses: (i) aplikasi sampel pada
fasa diam; (ii) tahap developing dimana fasa gerak bergerak menuju batas atas lempeng TLC; (iii)
developing warna; menentukan migrasi senyawa-senyawa yang dipisahkan; (iv) menghitung nilai
Rf (Retardation Factor).
Untuk memperoleh pengukuran pergerakan senyawa (jarak migrasi) pada kromatografi lapis tipis
dapat dihitung nilai Rf dari masing-masing komponen yag dipisahkan pada kromatogram. Nilai Rf
ditentukan sebagai berikut:
Jarak yang ditempuh komponen
Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 1
KIS2101 Praktikum Kimia Organik Semester Gasal 2017/2018 Modul 6

Ilustrasi kromatografi lapis tipis:

1 cm
batas akhir pergerakan pelarut

komponen B

komponen A
titik awal sampel
2 cm

Sebelum direndam dalam pelarut Setelah direndam dalam pelarut

Dengan menggunakan nilai Rf akan diidentifikasi dua pigmen utama pada tomat yaitu -karoten
(warna kuning-oranye) dan likopen (warna merah). Struktur masing-masing komponen adalah
sebagai berikut:

-karoten

Likopen

Warna dari kedua pigmen tersebut ditentukan oleh ikatan rangkap yang terdapat pada strukturnya.

1.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan salah satu tehnik pemisahan yang sangat berguna untuk
pemisahan dan pemurnian suatu senyawa dalam campuran. Prinsip kromatografi kolom
didasarkan pada perbedaan adsorpsi senyawa pada adsorben. Adsorben yang umum digunakan
pada kromatografi kolom adalah silika, alumina, kalsium karbonat, kalsium fosfat, magnesium,
pati dsb. Pemilihan adsorben didasarkan pada sifat pelarut dan adsorben. Kecepatan gerak
komponen yang dipisahkan bergantung pada aktivitas adsorben dan polaritas pelarut. Jika aktivitas
adsorben sangat tinggi dan polaritas pelarut rendah, maka pemisahan berlangsung lambat tapi
memberikan pemisahan yang baik. Jika aktivitas adsorben rendah dan polaritas pelarut tinggi,

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 2

KIS2101 Praktikum Kimia Organik Semester Gasal 2017/2018 Modul 6

pemisahan berlangsung cepat maka akan menghasilkan pemisahan kurang baik, senyawa yang
dipisahkan tidak 100% murni.
Adsorben biasanya dibuat dalam bentuk seperti adukan semen (slurry) dengan cairan yang sesuai
dan ditempatkan dalam tabung silinder yang bagian ujung bawahnya ditaruh glass wool atau pasir
(sea sand). Campuran yang akan dipisahkan dan yang telah dilarutkan dalam pelarut yang sesuai
dituang ke dalam kolom dan dibiarkan bergerak melewati kolom. Selama campuran bergerak
melewati kolom komponen-komponen dalam campuran akan diadsorpsi pada daerah-daerah yang
berbeda begantung pada kemampuannnya diserap oleh adsorben. Setelah semua campuran
melewati kolom biasanya dilakukan pencucian kolom dengan mengalirkan pelarut tertentu untuk
menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak terserap. Komponen yang berbeda yang telah
diserap pada adsorben dapat dikumpulkan secara terpisah dengan mengalirkan pelarut yang sesuai
pada kolom; proses ini disebut elusi. Komponen yang ditampung pada proses elusi disebut eluen.
Komponen yang diserap dengan ikatan yang lebih lemah akan terelusi lebih dahulu. Fraksi-fraksi
yang berbeda ditampung secara terpisah, kemudian dapat dilakukan identifikasi terhadap
kompomen-komponen tersebut.

II. Tujuan Percobaan

1. Memahami prinsip-prinsip kromatografi.
2. Memisahkan pigmen tanaman dengan tehnik kromatografi lipis tipis dan kromatografi kolom.

III. Alat dan Bahan

1. Gelas kimia 250 ml 10. Alumina
2. Tabung reaksi 11. Heksana
3. Gelas ukur 12. Aseton : Heksana (1:9)
4. Pelat TLC 13. -karoten standar
5. Pipa kapiler
6. Kolom kromatografi
7. Statif dan klem
8. Pipet tetes
9. Corong kaca

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 3

KIS2101 Praktikum Kimia Organik Semester Gasal 2017/2018 Modul 6

IV. Prosedur Percobaan

4.1. Kromatografi Lapis Tipis (TLC)

1. Tandai lempeng kromatografi yang telah disediakan dengan pensil seperti pada gambar di
bawah ini:

1 1 cm

10 cm
10

1 2 3
2 cm

5 cm

buat garis horizontal pada ujung atas, 1 cm dari ujung atas dan bawah 2 cm dari
ujung bawah lempeng TLC)
beri nomor 1 - 3 yang berjarak sekitar 1,5 cm di bawah garis awal seperti pada
gambar.

2. Dengan menggunakan pipa kapiler ambil sampel dengan cara mencelupkan pipa kapiler ke
dalam larutan lalu totolkan pada permukaan lempeng TLC dengan cara menyentuhkan
ujung pipa kapiler pada plat TLC (tepat di atas nomor yang telah ditandai sebelumnya).
Usahakan diameter spot tidak lebih dari 2 mm. Pemisahan akan lebih baik jika spot tidak
terlalu besar. Lakukan hal yang sama pada tempat sampel yang lain.

3. Setelah selesai biarkan sebentar sampai sampel kering. Simpan ekstrak pigmen anda dalam
lemari tertutup dan jangan lupa untuk menutupnya dengan aluminium foil.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 4

KIS2101 Praktikum Kimia Organik Semester Gasal 2017/2018 Modul 6

4. Tuangkan pelarut aseton:heksana (1:9) yang telah disipakan ke dalam gelas kimia 250 ml
hingga tinggi pelarut kira-kira 1 cm dari dasar gelas kimia.
5. Taruh plat TLC ke dalam gelas kimia yang telah berisi pelarut. Perhatikan spot sampel harus
berada di atas pelarut dan jangan sampai menutupi spot sampel. Tutup gelas kimia dengan
aluminuim foil dan biarkan pelarut bergerak sampai batas atas yang telah ditandai pada lempeng
TLC. Jangan lupa untuk dicek sekali-kali untuk menghindari pelarut melewati garis batas atas
lempeng TLC.
7. Setelah pelarut mencapai garis batas atas, keluarkan lempeng TLC dari gelas kimia dan taruh
dalam lemari asam untuk beberapa saat sampai pelat TLC kering.
8. Beri tanda pada noda yang terbentuk dengan cara melingkarinya dengan pinsil. Catat warna
noda yang terdapat pada kromatogram.
9. Ukur jarak migrasi noda pigmen dan tentukan Rf masing-masing pigmen.
10.Jika noda pada kromatogram memudar dapat divisualisasi dengan memaparkan uap iodin pada
lempeng TLC. Taruh lempeng TLC dalam gelas kimia yang berisi kristal iodin. Tutup gelas
kimia dengan aluminium foil dan panaskan di atas hot plate dengan panas sedang untuk
meningkatkan sublimasi iodin. Uap iodin akan berinteraksi dengan noda pigmen yang memudar
sehingga dapat terlihat jelas kembali. Setelah noda terlihat jelas keluarkan lempeng TLC dan
tandai segera, karena noda akan memudar kembali jika terkena udara.

4.2. Kromatografi Kolom

1. Siapkan kolom kromatografi dengan diameter 1,6 cm dan panjang kira-kira 13 cm. Taruh glass
wool pada ujung kolom dengan didorong menggunakan batang pengaduk. Alirkan sedikit
heksana untuk membasahi glass wool.
2. Timbang 10 g aluminium oksida (alumina) dalam beker gelas 100 mL lalu tambahkan 10 mL
heksana dan aduk pelan-pelan dengan batang pengaduk. Setelah tercampur rata, tuang slurry ke
dalam kolom kromatografi dengan bantuan corong gelas (tutup keran kolom selama menuang
slurry). Biarkan alumina turun dan memadat dalam kolom sampai kira-kira diperoleh 10 cm
kolom alumina. Keluarkan secara perlahan-lahan pelarut, tapi jangan biarkan alumina kering.
Sisakan pelarut kira-kira setinggi 0,5 cm di atas resin alumina. Jika terdapat alumina menempel
pada dinding kolom, dorong ke bawah dengan menambahkan pelarut.
3. Tuang 0,5 1 mL ekstrak pigmen anda ke dalam kolom dengan bantuan pipet tetes. Biarkan
ekstrak pigmen mengalir dalam kolom kemudian buka keran kolom. Tampung pelarut dalam
beker gelas. Ingat selalu untuk meninggalkan pelarut kira-kira 0,5 cm di atas kolom alumina.
4. Alirkan 10 ml heksana ke dalam kolom untuk mencuci sampel dan tampung pelarut yang keluar.
Ingat untuk selalu menyisakan pelarut kira-kira setinggi 0,5 cm di atas resin alumina
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 5
KIS2101 Praktikum Kimia Organik Semester Gasal 2017/2018 Modul 6

5. Pada saat pelarut mengalir maka akan terlihat migrasi dari pigmen yang terpisah menjadi dua
pita pada kolom. Jika pigmen yang bergerak lebih cepat hampir mencapai ujung bawah kolom,
tutup keran kolom. Amati warna-warna pigmen yang terpisah dan sejauh mana pigmen
bermigrasi dari ujung atas kolom. Catat jarak migrasi pigmen-pigmen tersebut.
6. Pigmen yang terpisah tersebut dapat ditampung secara terpisah dengan mengalirkan pelarut
aseton-heksana (1:9). Pigmen yang bergerak lebih cepat ditampung terlebih dahulu pada beker
gelas kimia 50 mL. Pigmen yang pertama ditampung sampai eluen yang keluar tidak berwarna
lagi. Tutup gelas kimia yang berisi pigmen pertama dengan aluminium foil dan simpan dalam
lemari tertutup. Lakukan hal yang sama untuk pigmen kedua.

7. Simpan pigmen-pigmen yang tertampung dalam tabung reaksi yang terpisah dan ditutup dengan
aluminium foil.

REFERENSI

Frederick Bettelheim and Joseph Landesberg, 2000, Laboratory Experiments for General,
Organic & Biochemistry 4th ed. Harcourt Brace College, London.

Catatan:
Jangan lupa membawa pinsil dan penggaris.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 6