POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi DNA secara in vitro.
Pertama kali dikembangkan oleh Dr. Kary Mullis pada
tahun 1983 dan meraih Nobel pada tahun 1993.
PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang stabil
pada suhu tinggi (thermostable enzyme) seperti Taq
DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus
aquaticus.
Pada PCR, DNA dipolimerisasi dalam siklus berulang
dari pemanasan dan pendinginan untuk mencapai
akumulasi logaritmik dari produk DNA.
Pada kloning PCR digunakan untuk isolasi dan
memperbanyak fragmen DNA atau gen yang akan
diklon.
Syarat untuk dapat melakukan isolasi DNA dan
memperbanyak gen dengan PCR; harus tahu urutan
DNA-nya, setidaknya pada daerah ujung 5’ dan 3’.
 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR:

1. Fragmen DNA untai ganda yang akan diamplifiaksi, yang

disebut sebagai templat.

2. Dua segmen DNA untai tunggal (oligonukleotida) yang

disebut sebagai primer. Primer adalah DNA untai tunggal
yang akan menempel pada DNA target dan yang
menentukan daerah yang diamplifikasi pada templat DNA.

3. DNA polimerase.

4. dNTP (deoksinukleosida trifosfat); dATP, dCTP, dGTP,

dTTP.

5. Buffer yang mengandung Mg2+.

 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kondisi siklus temperatur pada proses PCR:

 Pre denaturasi pada suhu 94C - 96C selama 1 – 2 menit

untuk membuat semua untai ganda DNA telah terpisah
pada awal proses dan untuk mengaktivasi DNA
polimerase.

 Denaturasi pada suhu 94C - 96C, untuk memisahkan

untai ganda.

 Annealing pada suhu yang bervariasi bergantung pada

urutan basa primer, biasanya berkisar antara 45C - 65C
selama 30 – 45 detik. Pada tahap ini primer menempel
pada urutan DNA tertentu pada templat.
 Extension atau tahap polimerisasi pada suhu 72C dengan
waktu yang bervariasi bergantung pada kecepatan enzim
dan panjang DNA target.
 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kondisi siklus temperatur pada proses PCR (cont’d)

Final extension pada suhu 72C dengan waktu yang

bervariasi, pada umumnya 3x waktu extension. Tahap
ini berfungsi untuk menyempurnakan polimerisasi.

Hold atau penyimpanan pada suhu 4C dengan waktu

yang tak terbatas, gunanya untuk penyimpanan jika
sampel tidak langsung diproses. Suhu rendah untuk
mencegah polimerisasi lebih lanjut.

Tahap denaturasi, annealing dan extension diulang

sampai 25 – 30 kali.
 Siklus pertama PCR Siklus kedua PCR
Jeremy and Malcom, 2002, From Genes to Genome: Concepst and Applications of DNA Technology
 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Contoh siklus temperatur PCR

 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Hasil PCR pada umumnya dianalisa dengan:

• menggunakan elektroforesis DNA, dengan
melihat ukuran DNA produk PCR
• dapat juga ditentukan urutan basa DNA-nya
dengan sekuensing DNA.

Contoh elektroforesis DNA hasil PCR

 PERANCANGAN PRIMER UNTUK PCR

• Harus diketahui urutan DNA target (paling tidak pada

daerah ujung 5’ dan 3’.

• Primer: fragmen DNA untai tunggal berukuran pendek.

• Primer dirancang sepasang (sering disebut sebagai

primer forward dan reverse )

• Bisa dirancang manual atau menggunakan software

yang banyak tersedia online.

• Primer yang baik umumnya berukuran 22 – 24 basa,

memiliki suhu annealing 60C, dan GC content kurang
dari 50%
5’CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTAC3’
3’GTAATAGTTGTTTTATGAGGTTAACCGCTACCGGGACAGGAAAATGGTCTGTTGGTAATG5’

5’CTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTT3’
3’GACAGGTGTGTTAGACGGGAAAGCTTTCTAGGGTTGCTTTTCTCTCTGGTGTACCAGGAA5’
===================
++++++++++++++++++++
5’CTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA3’
3’GAACTCAAACATTGTCGACGACCCTAATGTGTACCGTACCTACTTGATATGTTTATT5’

Forward primer : urutan DNA yang komplemen dengan untai bawah (======)
dan arah 5’-3’, sehingga urutan primernya adalah:
5’-CTGTCCACACAATCTGCC -3’

Reverse primer: urutan DNA yang komplemen dengan untai atas (+++++) dan
arah 3’-5’, yang memiliki urutan 3’-GACCCTAATGTGTACCGTAC-5’ (ungu).
Tetapi primer selalu ditulis dengan arah 5’- 3’, sehingg urutan reverse
primernya adalah: 5’-CATGCCATGTGTAATCCCAG-3’
Melting Temperature (Tm)

• Menentukan temperatur annealing untuk PCR adalah

berdasarkan Tm.
.
• Tm adalah temperatur dimana populasi untai ganda
molekul DNA telah terdenaturasi sebagian, atau
sebagian untai ganda telah terpisah.

• Pada temperatur di atas Tm molekul DNA akan

berada pada untai tuggal (terdenaturasi).

• Di bawah Tm DNA kembali membentuk untai ganda.

Melting Temperature (Tm)

Untuk penempelan primer pada templat DNA, temperatur

annealing harus di bawah nilai Tm primer. Pada
umumnya sekitar 5ºC di bawah Tm.

Perbedaan Tm antara sepasang primer sebaiknya tidak

lebih dari 5º C.

Nilai Tm dari primer bergantung pada urutan DNA-nya.

Semakin besar persen GC makin tinggi nilai Tm.
Rumus Wallace berikut ini dapat digunakan untuk
menghitung Tm.
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
 PERANCANGAN PRIMER UNTUK PCR
Untuk tujuan kloning, urutan DNA tertentu yang merupakan
pengenalan enzim restriksi dapat ditambahkan pada primer.

• Urutan DNA pengenalan enzim

restriksi ditambahkan pada
ujung 5’ pada primer PCR.
• Fragmen DNA hasil PCR
dipotong dengan enzim
restriksi yang mengenali urutan
DNA yang ditambahkan
tersebut, dan diligasi ke
plasmid yang dipotong dengan
enzim enzim restriksi yang
sama
Jeremy and Malcom, 2002, From Genes to Genome:
Concepst and Applications of DNA Technology