31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DAN KROMATOGRAFI KOLOM

I. Latar Belakang
Kromatografi merupakan metode pemisahan dan pemurnian senyawa organik yang efektif dan
sangat berguna dan dapat digunakan untuk campuran kompleks. Kromatografi berasal dari
Bahasa Yunani; khromatos yang artinya warna dan graphos yang artinya menulis. Tehnik
kromatografi ditemukan oleh Mikhail Tswett pada tahun 1906.

Metode pemisahan pada kromatografi didasarkan pada distribusi senyawa-senyawa dalam

campuran antara fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase). Fasa diam dapat
berupa kolom adsorben kertas, adsorben lapis tipis pada pelat kaca dan sebagainya, dimana fasa
gerak berjalan. Fasa gerak dapat berupa cairan atau gas. Jika fasa diam adalah adsorben kolom
maka disebut sebagai kromatografi kolom, jika fasa diam yang digunakan adalah kertas disebut
kromatografi kertas, dan jika fasa diam yang digunakan adsorben lapis tipis disebut kromatografi
lapis tipis (Thin Layer Cromatography atau disingkat dengan TLC).

Fasa diam merupakan bahan yang solid dan inert yang mengandung gugus fungsi polar sehingga
senyawa polar akan memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fasa diam. Karena pemilihan
fasa diam pada umunya terbatas, maka variasi banyak dilakukan pada fasa gerak atau senyawa
organik yang digunakan. Fasa gerak atau pelarut yang baik bergantung pada campuarn senyawa
yang dipisahkan dan dapat merupakan campuran pelarut yang berbeda kepolarannya (contoh:
heksana dan etanol). Fasa gerak yang baik pada umumnya ditentukan dengan percobaan
menggunakan TLC.
Pada percobaan ini akan dilakukan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom untuk
pemisahan pigmen tanaman.

1.1. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis pada umumnya terdiri dari empat tahap proses: (i) aplikasi sampel pada
fasa diam; (ii) tahap developing dimana fasa gerak bergerak menuju batas atas lempeng TLC;
(iii) developing warna; menentukan migrasi senyawa-senyawa yang dipisahkan; (iv) menghitung
nilai Rf (Retardation Factor).
Untuk memperoleh pengukuran pergerakan senyawa (jarak migrasi) pada kromatografi lapis tipis
dapat dihitung nilai Rf dari masing-masing komponen yag dipisahkan pada kromatogram. Nilai
Rf ditentukan sebagai berikut:

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 1

 31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

Jarak yang ditempuh komponen

Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 2

31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

1.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan salah satu tehnik pemisahan yang sangat berguna untuk
pemisahan dan pemurnian suatu senyawa dalam campuran. Prinsip kromatografi kolom
didasarkan pada perbedaan adsorpsi senyawa pada adsorben. Pemilihan adsorben didasarkan
pada sifat pelarut dan adsorben. Adsorben yang umum digunakan pada kromatografi kolom
adalah gel silika SiO2.xH2O, alumina (Al2O3.xH2O), kalsium karbonat, kalsium fosfat,
magnesium, pati dsb. Senyawa-senyawa tersebut digunakan dalam bentuk serbuknya.
Jika kecepatan gerak komponen yang dipisahkan bergantung pada aktivitas adsorben dan
polaritas pelarut. Jika aktivitas adsorben sangat tinggi dan polaritas pelarut rendah, maka
pemisahan berlangsung lambat tapi memberikan pemisahan yang baik. Jika aktivitas adsorben
rendah dan polaritas pelarut tinggi, pemisahan berlangsung cepat maka akan menghasilkan
pemisahan kurang baik, senyawa yang dipisahkan tidak 100% murni.
Adsorben biasanya dibuat dalam bentuk seperti adukan semen (slurry) dengan cairan yang sesuai
dan ditempatkan dalam tabung silinder yang bagian ujung bawahnya ditaruh glass wool atau
pasir (sea sand). Jika senyawa organik dilewatkan pada kolom yang berisi adsorben, maka
senyawa organik tersebut akan teradsorbsi atau menempel pada partikel adsorben. Hal tersebut
karena adanya gaya intermolekul yang menyebabkan senyawa berikatan pada adsorben.
Kekuatan gaya intermolekul tersebut bervariasi bergantung pada jenis interaksinya. Senyawa
non-polar misalnya berikatan pada alumina hanya melalui gaya van der Waals. Ikatan ini bersifat
lemah karena senyawa non-polar tidak berikatan kuat pada alumina, kecuali senyawa organik
yang memiliki berat molekul yang sangat besar. Interaksi yang paling penting adalah interaksi
dengan senyawa

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 3

31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

polar, apakah gaya dipol-dipol atau interaksi langsung seperti ikatan koordinasi, ikatan hidrogen.
atau pembentukan garam. Urutan dari kekuatan ikatan tersebut adalah:
Pembentukan garam > koordinasi > ikatan hidrogen > dipol-dipol > van der Waals

Gambar 2. Interaksi yang mungkin terjadi antara senyawa organik dan alumina
(A Microscale Approach to Organic Laboratory Techniques 5th ed.)

Campuran yang akan dipisahkan dan yang telah dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dituang ke
dalam kolom dan dibiarkan bergerak melewati kolom. Selama campuran bergerak melewati
kolom komponen-komponen dalam campuran akan diadsorpsi pada daerah-daerah yang berbeda
begantung pada kemampuannnya diserap oleh adsorben. Setelah semua campuran melewati
kolom biasanya dilakukan pencucian kolom dengan mengalirkan pelarut tertentu untuk
menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak terserap. Komponen yang berbeda yang telah
diserap pada adsorben dapat dikumpulkan secara terpisah dengan mengalirkan pelarut yang
sesuai pada kolom; proses ini disebut elusi. Komponen yang ditampung pada proses elusi disebut
eluen. Komponen yang diserap dengan ikatan yang lebih lemah akan terelusi lebih dahulu.
Fraksi-fraksi yang berbeda ditampung secara terpisah, kemudian dapat dilakukan identifikasi
terhadap kompomen-komponen tersebut.

II. Tujuan Percobaan

1. Memahami prinsip-prinsip kromatografi.
2. Memisahkan pigmen tanaman dengan tehnik kromatografi lipis tipis dan kromatografi kolom.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 4

31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

III. Alat dan Bahan

1. Gelas kimia 250 ml 10. Alumina
2. Tabung reaksi 11. Heksana
3. Gelas ukur 12. Aseton : Heksana (1:9)
4. Pelat TLC 13. β-karoten standar
5. Pipa kapiler
6. Kolom kromatografi
7. Statif dan klem
8. Pipet tetes
9. Corong kaca

IV. Prosedur Percobaan

4.1. Kromatografi Lapis Tipis (TLC)

1. Tandai lempeng kromatografi yang telah disediakan dengan pensil seperti pada gambar
di bawah ini:

1
1 cm

10 cm
10

1 2 3
2 cm

5 cm

 buat garis horizontal pada ujung atas, 1 cm dari ujung atas dan bawah 2 cm dari
ujung bawah lempeng TLC)
 beri nomor 1 - 3 yang berjarak sekitar 1,5 cm di bawah garis awal seperti
pada gambar.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 5

31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

2. Dengan menggunakan pipa kapiler ambil sampel dengan cara mencelupkan pipa kapiler
ke dalam larutan lalu totolkan pada permukaan lempeng TLC dengan cara menyentuhkan
ujung pipa kapiler pada plat TLC (tepat di atas nomor yang telah ditandai sebelumnya).
Usahakan diameter spot tidak lebih dari 2 mm. Pemisahan akan lebih baik jika spot tidak
terlalu besar. Lakukan hal yang sama pada tempat sampel yang lain.

3. Setelah selesai biarkan sebentar sampai sampel kering. Simpan ekstrak pigmen anda dalam
lemari tertutup dan jangan lupa untuk menutupnya dengan aluminium foil.
4. Tuangkan pelarut aseton:heksana (1:9) yang telah disiapkan ke dalam gelas kimia 250 ml
hingga tinggi pelarut kira-kira 1 cm dari dasar gelas kimia.
5. Taruh plat TLC ke dalam gelas kimia yang telah berisi pelarut. Perhatikan spot sampel harus
berada di atas pelarut dan jangan sampai menutupi spot sampel. Tutup gelas kimia dengan
aluminuim foil dan biarkan pelarut bergerak sampai batas atas yang telah ditandai pada
lempeng TLC. Jangan lupa untuk dicek sekali-kali untuk menghindari pelarut melewati garis
batas atas lempeng TLC.
7. Setelah pelarut mencapai garis batas atas, keluarkan lempeng TLC dari gelas kimia dan taruh
dalam lemari asam untuk beberapa saat sampai pelat TLC kering.
8. Beri tanda pada noda yang terbentuk dengan cara melingkarinya dengan pinsil. Catat warna
noda yang terdapat pada kromatogram.
9. Ukur jarak migrasi noda pigmen dan tentukan Rf masing-masing pigmen.
10. Jika noda pada kromatogram memudar dapat divisualisasi dengan memaparkan uap iodin
pada lempeng TLC. Taruh lempeng TLC dalam gelas kimia yang berisi kristal iodin. Tutup
gelas kimia dengan aluminium foil dan panaskan di atas hot plate dengan panas sedang untuk
meningkatkan sublimasi iodin. Uap iodin akan berinteraksi dengan noda pigmen yang
memudar sehingga dapat terlihat jelas kembali. Setelah noda terlihat jelas keluarkan lempeng
TLC dan tandai segera, karena noda akan memudar kembali jika terkena udara.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 6

31S1202 Praktikum Kimia Organik Semester Genap 2020/2021

4.2. Kromatografi Kolom

1. Siapkan kolom kromatografi dengan diameter 1,6 cm dan panjang kira-kira 13 cm. Taruh
glass wool pada ujung kolom dengan didorong menggunakan batang pengaduk. Alirkan
sedikit heksana untuk membasahi glass wool.
2. Timbang 10 g aluminium oksida (alumina) dalam beker gelas 100 mL lalu tambahkan 10 mL
heksana dan aduk pelan-pelan dengan batang pengaduk. Setelah tercampur rata, tuang slurry
ke dalam kolom kromatografi dengan bantuan corong gelas (tutup keran kolom selama
menuang slurry). Biarkan alumina turun dan memadat dalam kolom sampai kira-kira
diperoleh 10 cm kolom alumina. Keluarkan secara perlahan-lahan pelarut, tapi jangan biarkan
alumina kering. Sisakan pelarut kira-kira setinggi 0,5 cm di atas resin alumina. Jika terdapat
alumina menempel pada dinding kolom, dorong ke bawah dengan menambahkan pelarut.
3. Tuang 0,5 – 1 mL ekstrak pigmen anda ke dalam kolom dengan bantuan pipet tetes. Biarkan
ekstrak pigmen mengalir dalam kolom kemudian buka keran kolom. Tampung pelarut dalam
beker gelas. Ingat selalu untuk meninggalkan pelarut kira-kira 0,5 cm di atas kolom alumina.
4. Alirkan 10 ml heksana ke dalam kolom untuk mencuci sampel dan tampung pelarut yang
keluar. Ingat untuk selalu menyisakan pelarut kira-kira setinggi 0,5 cm di atas resin alumina
5. Pada saat pelarut mengalir maka akan terlihat migrasi dari pigmen yang terpisah menjadi dua
pita pada kolom. Jika pigmen yang bergerak lebih cepat hampir mencapai ujung bawah
kolom, tutup keran kolom. Amati warna-warna pigmen yang terpisah dan sejauh mana
pigmen bermigrasi dari ujung atas kolom. Catat jarak migrasi pigmen-pigmen tersebut.
6. Pigmen yang terpisah tersebut dapat ditampung secara terpisah dengan mengalirkan pelarut
aseton-heksana (1:9). Pigmen yang bergerak lebih cepat ditampung terlebih dahulu pada beker
gelas kimia 50 mL. Pigmen yang pertama ditampung sampai eluen yang keluar tidak berwarna
lagi. Tutup gelas kimia yang berisi pigmen pertama dengan aluminium foil dan simpan dalam
lemari tertutup. Lakukan hal yang sama untuk pigmen kedua.

7. Simpan pigmen-pigmen yang tertampung dalam tabung reaksi yang terpisah dan ditutup
dengan aluminium foil.

REFERENSI

1. Donald L. Pavia, Gary M. Lampman, George S. Kriz, Randall G. Engel, 2013, A

Microscale Approach to Organic Laboratory Techniques 5th ed, Brooks/Cole, USA.
2. Frederick Bettelheim and Joseph Landesberg, 2000, Laboratory Experiments for
General, Organic & Biochemistry 4th ed. Harcourt Brace College, London.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 7