Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang lebih dikenal dibandingkan

dengan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik analisis pemisahan
sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-
senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara
kromatografi gas.
Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu
berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang
berbeda fasanya (fasa diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan
aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada
kolom serta dialiri fase gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis
dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fase (gerak
dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya,
maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak lebih perlahan
didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah
komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta
mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Teknik dalam HPLC :
a. Sebagai fase mobil/fase gerak berbentuk cairan.
b. Sebagai fase stasioner/fase diam, dapat berbentuk padatan atau cairan.
Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:



Keunggulan HPLC diantaranya adalah:
a. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC
dilakukan pada suhu kamar.
b. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
c. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat
tinggi seperti polimer.
Jenis-jenis kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) yaitu :
a. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak
polar. Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis
kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut
jugakromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis
kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar
daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas
sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak
digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling
banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi
partisi memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang
dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi
terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-
solut bervariasi.
3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.
5) Lebih ekonomis.
d. Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-
molekul yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini
berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.
e. Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi
ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking
kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom
secara cepat dan dikenal dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini
berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan
biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih.
Di bawah ini beberapa komponen-komponen KCKT secara umum, antara lain :
a. Eluen (pelarut)
Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut
organik dan larutan yang digunakan untuk KCKT haruslah terbebas dari partikel-partikel dari
gas/udara. Hal ini dikarenakan:
1) Adanya partikel dalam larutan bisa terbawa masuk ke dalam pompa, hal ini dapat
mengakibatkan tersumbatnya aliran pelarut tersebut.
2) Udara yang masuk ke dalam pompa dapat mengganggu kestabilan pemompaan dan jumlah
volume tetap yang dipakai akan terganggu.
3) Selain itu pada kolom dan detektor akan mengalami gangguan.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi
sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan
detektor.
b. Sistem Pemompaan
Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa
persyaratan :
1) Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
2) Keluaran yang bebas denyut
3) Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 ml/menit
4) Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik
5) Tahan terhadap korosi.
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume
internalnya kecil sekitar 35 400 l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi
menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom
dan akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringedengan sebuah
penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak
dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas
pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh
gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis
pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya
sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat
digunakan untuk sistem elusi gradien.
c. Injeksi sampel
Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini
dapat menyebabkan pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas.
Sebagai akibatnya, volume injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 l.
Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup
elastomer. Syringeyang digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi. Aliran
dihentikan sementara saat injeksi dan dikembalikan setelah sampel masuk ke aliran fasa
gerak.
Metode pemasukkan sampel yang paling umum digunakan adalah dengan
menggunakansampling loop. Seringkali disatukan dalam sistem KCKT dengan kapasitas
beragam 0,5 hingga 500 l (Skoog et al., 1998)
d. Kolom KCKT
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk
tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT
memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan
dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran
partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000
lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan
kecepatan dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm
dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga
100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan
sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi
pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi
(chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel
berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak
berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m. Lapisan tipis
berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan
pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3
10m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar
kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara
kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
e. Detektor
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10
-8
hingga 10
-
15
gram zat terlarut per pembacaan
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi.
Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil
mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 10 l dengan panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel
detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-
fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya
dan filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada
instrumen yang lebih baik dengangratting sebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui
sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara
bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus
akan dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh
penggunaan detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada
kecepatan alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan,
dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.






















Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
19 JUNI 2011 BY FAUZAN MARS






2 Votes


Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif
telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi.metode ini dikenal dengan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT).
KCKT adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul,
senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-
kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan
berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam
padat atau cair yang aktif.
Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu:
1. Sistem elusi isokratik (isocratic elution)
Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama
analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k
(rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang buruk dan
sukar mendeteksi pita elusinya.
2. Sistem elusi gradient (gradient elution)
Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses
berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom,
setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. Pada akhirnya harga k
akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan bermigrasi sepanjang kolom
secara cepat sampai ia keluar dari kolom.
Persamaan elusi gradient :
Waktu retensi = tg =tMk log (2,3 k
o
/k)
Resolusi = Rs =[(1/4)(-1)N
1/2
] [k/1+ k]
Lebar pita = =1/2[V
M
(1+k)N
1/2
]
Dimana :
Ko = nilai k pada awal pemisahan
tg = waktu retensi pada elusi gradien
g = lebar pita gradien
tM = waktu transit zat yang ditahan
= retensi relatif
V
M
= volume gerak
N = jumlah pelat (kromotof)
Nilai k selama migrasi harus berkisar pada rentang 1<10. Pada saat keluar kolom, k menjadi
(~1). Nilai k kecil pada saat elusi menghasilkan pita tajam dan berarti sensitifitasnya tinggi.
3. Sistem elusi bertahap
Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat,
yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung senyawa
dengan nilai k setelah sampai diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara bertahap diganti.
Hasil sistem KCKT dan optimasinya sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain :
a. Temperatur
b. Tekanan
c. Diameter partikel fase diam
d. Viskositas
e. Panjang kolom
Beberapa jenis teknik pemisahan dalam KCKT telah dikembangkan berdasarkan jenis fase
diam dan fase geraknya:
a. Kromatografi adsorpsi
Fase diam yang biasa digunakan adalah bahan alam polar seperti partikel silika atau alumina
hidrat. Fase mobil berkompetisi terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fase diam.
Komponen yang terikat lebih kuat akan tertahan lebih lama di dalam kolom. Waktu retensi
bergantung pada kepolaran sampel.
b. Kromatografi partisi
Linarut dibagi atas fase gerak cair dengan cairan yang tidak bercampur yang dilapiskan pada
suatu patikel padat sebagai fase diam. Fase diam dapat berupa fase diam yang disalutkan
pada partikel penyangga. Kolom fase terikat (bonded-fase colum) merupakan kolom yang
paling umum digunakan.
c. Kromatografi penukar ion
Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fase gerak dan fase diam pada lokasi penukaran
ion. Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat yang berbeda.