LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIA

TEKNIK UJI AKTIVITAS ANTI BAKTERI

Kelompok III
Wulan Safitri
F1C118029

Dosen Pengampu:
1. Drs. Nelson, M.Si.
2. Indra Lasmana Tarigan, S.Pd., M.Sc.

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI DAN REKAYASA I

PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS JAMBI
2021
 PERCOBAAN 2
TEKNIK UJI AKTIVITAS ANTI BAKTERI

I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu melakukan uji aktivitas antibakteri.
2. Mahasiswa mampu menentukan konsentrat hambat tumbuh minimum
(KHTM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) dari senyawa antibakteri.

II. Landasan Teori

Antibakteri adalah zat yang menekan pertumbuhan atau reproduksi
bahkan membunuh bakteri. Antibakteri terbagi atas dua berdasarkan
mekanisme kerjanya, yaitu bakteriostatika yang bersifat menghambat
pertumbuhan bakteri dan bakterisida yang bersifat membunuh bakteri.
Antibakteri dapat memiliki aktivitas bakteriosatika menjadi aktivitas bakterisida
apabila kadarnya ditingkatkan melebihi kadar hambar minimal (KHM). Target
mekanisme antibakteri yaitu perusakan dinding sel, pengubahan permeabilitas
sel, penghambatan kerja enzim, penghambatan sintesis asam nukleat dan
protein, dan pengubahan molekul protein dan asam nukleat (Rollando, 2019).
KHM adalah konsentrasi minimal zat antimikroba yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh
koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati banyaknya koloni bakteri
yang tumbuh. KHM juga merupakan teknik untuk menentukan konsentrasi
minimum zat antimikroba yang dibutuhkan dalam menghambat pertumbuhan
suatu mikroorganisme. Konsentrasi hambatan minimum (KHM) menyatakan
bahwa prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi antibiotik yang
masih efektif untuk mencegah pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis
antibiotik yang efektif yang digunakan untuk mengontrol infeksi yang terjadi pada
pasien (Saputera et al., 2019).
Hasil uji aktivitas antibakteri pelarut etanol menunjukkan dapat
menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif tetapi tidak dapat menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif. Hal ini dapat disebabkan oleh tingginya
konsentrasi etanol yang digunakan (>98%). Etanol absolut memiliki efek
bakterisidal yang lebih lemah dibandingkan campuran antara alkohol dan air.
Meskipun demikian, etanol pada konsentrasi 60-99% masih dapat menghambat
pertumbuhan gram negative. n-Heksan tidak menunjukkan aktivitas antibakteri
terhadap bakteri gram positif dan negatif. Aktivitas antibakteri dipengaruhi oleh
polaritas senyawa yang diekstraksi oleh masing-masing pelarut dengan
kemampuan zat tersebut untuk menyebar pada media berbeda yang digunakan
dalam pengujian aktivitas antibakteri (Fitriah et al., 2017)
III. Alat dan Bahan

A. Alat
- Autopipet
- Incubator
- pH meter
- Cawan petri
- Jarum ose
- Neraca analitik
- Spektrofotometer
- Tabung reaksi
- Pipet tetes

B. Bahan
- Bakteri (gram negative : E.coli, gram positif: Bacillus subtillis)
- Larutan baku McFarland 0.5 (BaCl2 1%, larutan H2SO4)
- Media NA
- Media NB
- Kapas
- Aluminium foil
- Akuades
- Kloramphenikol
IV. Skema Kerja
A. Pembuatan Larutan baku Mc. Farland 0,5
Larutan baku Mc.Farland terdiri dari larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1%.
Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl2 1% dicampurkan dengan 9,95 ml H2SO4
1%, dikocok hingga homogen.
Kekeruhan larutan diukur pada Panjang gelombang 450 nm dengan
menggunakan aquades sebagai blanko. Nilai adsorben larutan baku harus
berada pada kisaran 0,08 sampai dengan 0,13. Larutan baku Mc. Farland
0,5 ekuivalen dengan suspense sel bakteri dengan konsentrasi 1,5 x 10 8
CFU/ml (nilai absorban 0,138).

B. Penentuan Aktivitas Antibakteri

- Peremajaan Bakteri Uji

Peremajaan bakteri dilakukan dengan menginokulasi bakteri uji ke

dalam media NA dan diinkubasii selama 24 jam pada suhu 37 oC. Koloni
yang tumbuh pada media kemudian dipindahkan ke dalam 10 mL media
NB secara aseptic dan disesuaikan serapannya dengan larutan abku Mc.
Farland 0,5 sehingga diperoleh suspense bakteri dengan jumlah sel 1,5 x
108 CFU/ml.

- Pengujian Aktivitas Antibakteri

Senyawa antibakteri dimasukkan ke dalam sumur cawan mikro dan
diencerkan dengan berbagai konsentrasi dengan menggunakan media NB
steril. Senyawa antibakteri yang digunakan berupan antibiotic dengan
berbagi konsentrasi (0,001%, 0,01%, 1%). Kemudian sebanyak 5 μl
suspense bakteri uji yang distandarisasi jumlah sel dengan NaCl 0,85 %
dimasukkan kedalam sumur cawan mikro dan diinkubasi selama 24 jam
pada incubator 37oC. Volume total campuran senyawa antibakteri, media
NB dan suspense sel bakteri adalah 200 μl. setelah 24 jam, cawan mikro
diamani berdasarkan prinsip turbidimetri. Konsentrasi paling jernih
(tidak keruh) ditetapkan sebagai konsentrasi hambat minimum. Penetuan
konsentrasi bunuh minimum dilakukan dengan melakukan subkultur 50
μl suspense yang jernih ke dalam media NA lalu diamati setelah 24 jam.
Konsentrasi bunuh minimum adalah yang membutuhkan Sebagian besar
bakteri. Kontrol negative yang digunakan berupa media dan bakteri uji.
V. Hasil dan Pembahasan
Antibakteri adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan atau bahkan
mematikan bakteri dengan cara mengganggu metabolisme mikroba yang
merugikan. Mikroorganisme dapat menyebabkan bahaya karena kemampuan
menginfeksi dan menimbulkan penyakit serta merusak bahan pangan.
Antibakteri termasuk kedalam antimikroba yang digunakan untuk menghambat
pertumbuhan bakteri. Mekanisme kerja dari senyawa antibakteri diantaranya
yaitu menghambat sintesis dinding sel, menghambat keutuhan permeabilitas
dinding sel bakteri, menghambat kerja enzim, dan menghambat sintesis asam
nukleat dan protein.

Pada percobaan ini metode yang digunakan dalam pengujian aktivitas

antibakteri yaitu dilusi cair yang didasarkan pada prinsip pengenceran. Metode
ini dipilih karena prinsip dari metode ini adalah pengenceran larutan uji sampai
diperoleh seri kadar dan pada masing- masing larutan uji ditambah suspensi
bakteri. Hal tersebut memungkinkan terjadinya interaksi yang homogen antara
larutan uji dengan suspensi bakteri sehingga penghambatan terhadap bakteri
bisa lebih sensitif. Selain itu, pada metode ini penggunaan media dan bahan uji
lebih hemat dan tidak dipengaruhi oleh tebal tipisnya media. Parameter yang
digunakan adalah Kadar Bunuh Minimum (KBM). Tahap awal uji aktivitas
antibakteri adalah proses sterilisasi alat agar tidak terjadi kontaminasi dan tidak
mengganggu proses penelitian. Tahap selanjutnya yaitu proses pembuatan
larutan baku Mc. Farland 0,5. Larutan baku Mc.Farland terdiri dari larutan BaCl2
1% dan H2SO4 1%. Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl2 1% dicampurkan dengan
9,95 ml H2SO4 1%, dikocok hingga homogen. Kekeruhan larutan diukur pada
Panjang gelombang 450 nm dengan menggunakan aquades sebagai blanko.
Blanko merupakan suatu larutan yang tidak mengandung analit. Nilai absorban
larutan baku Mc. Farland 0,5 ekuivalen dengan suspense sel bakteri dengan
konsentrasi 1,5 x 108 CFU/ml (nilai absorban 0,138).

Adapun untuk penentuan aktivitas antibakteri dilakukan 2 tahapan yaitu

peremajaan dan bakteri dan pengujian aktivitas antibakteri. Tahap pertama yaitu
peremajaan bakteri yang dilakukan dengan menginokulasi bakteri uji ke dalam
media NA dan diinkubasii selama 24 jam pada suhu 37 oC. Koloni yang tumbuh
pada media kemudian dipindahkan ke dalam 10 mL media NB secara aseptic dan
disesuaikan serapannya dengan larutan abku Mc. Farland 0,5 sehingga diperoleh
suspense bakteri dengan jumlah sel 1,5 x 108 CFU/ml.

Tahapan selanjutnya yaitu pengujian aktivitas antibakteri. Dimana

senyawa antibakteri dimasukkan ke dalam sumur cawan mikro dan diencerkan
dengan berbagai konsentrasi dengan menggunakan media NB steril. Senyawa
antibakteri yang digunakan berupan antibiotic dengan berbagi konsentrasi
(0,001%, 0,01%, 1%). Kemudian sebanyak 5 μl suspense bakteri uji yang
distandarisasi jumlah sel dengan NaCl 0,85 % dimasukkan kedalam sumur
cawan mikro dan diinkubasi selama 24 jam pada incubator 37 oC. Volume total
campuran senyawa antibakteri, media NB dan suspense sel bakteri adalah 200
μl. setelah 24 jam, cawan mikro diamani berdasarkan prinsip turbidimetri.
Konsentrasi paling jernih (tidak keruh) ditetapkan sebagai konsentrasi hambat
minimum. Penetuan konsentrasi bunuh minimum dilakukan dengan melakukan
subkultur 50 μl suspense yang jernih ke dalam media NA lalu diamati setelah 24
jam. Konsentrasi bunuh minimum adalah yang membutuhkan Sebagian besar
bakteri. Berikut merupakan data hasil percobaan ekstrak n-heksan daun A :

Tabel 1. Hasil Percobaan

Sampel Daya hambat (OD)/Zona Inhibisi Rata-rata Kriteria
(600 ppm)
1 2 3
Kontrol + 0.559 0.589 0.599 0,582
(Ampicilin)
Kontrol – 0.989 0.988 0.979 0,985
Aquades
Ekstrak n-Heksan Daun A
5% 0.811 0.80 0.790 0,800 Lemah
10% 0.751 0.765 0.760 0,758 Lemah
15% 0.703 0.710 0.711 0,708 Lemah
25% 0.662 0.670 0.677 0,669 Lemah
35% 0.611 0.62 0.633 0,621 Lemah
50% 0.60 0.620 0.610 0,61 Lemah

Bakteri yang digunakan pada percobaan ini adalah E.coli dan Bacillus
subtillis. Bakteri E-coli merupakan bakteri gram negatif. Kelompok bakteri gram
negatif mempunyai sifat kurang rentan terhadap beberapa antibiotik. Hal ini
dikarenakan struktur dinding sel bakteri gram negatif relatif lebih kompleks dan
berlapis tiga dimana lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa
lipopolisakarida, dan lapisan dalam berupa peptidoglikan. Sedangkan bakteri
Bacillus subtillis merupakan bakteri jenis gram positif.

Zona hambatan yang terbentuk pada semua kelompok perlakuan estrak

n-Heksan menunjukan bahwa terdapat daya hambat pada E. coli. Terdapat
perbedaan zona hambatan yang terbentuk pada masing-masing konsentrasi.
Semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang digunakan, maka semakin besar zona
hambatan yang terbentuk. Namun dari hasil percobaan didapatkan semakin
besar konsentrasi yang digunakan, daya hambat atau zona inhibisi yang
terbentuk semakin kecil. Dari table diatas diketahui bahwa konsentrasi 5%
memiliki nilai rata-rata diameter zona hambat terbesar dibandingkan dengan
konsentrasi 10%, 15%, 25%, 35% dan 50% yaitu sebesar 0,800. Zona hambat
yang terbentuk dari konsentrasi efektif lebih kecil dibandingkan zona hambat
pada kontrol positif. Terdapat penurunan diameter zona hambat antara
konsentrasi 5% dengan konsentrasi 10% dan 50%. Salah satu faktor yang dapat
mempengaruhi hasil diameter zona hambat dengan metode Kirby-Bauer adalah
kemampuan ekstrak untuk berdifusi kedalam kertas cakram. Ekstrak yang
digunakan dalam uji ini termasuk dalam ekstrak kental. Semakin tinggi
konsentrasi ekstrak yang digunakan maka semakin tinggi pula viskositasnya.
Semakin tinggi viskositas suatu ekstrak maka proses difusi suatu zat antibakteri
kedalam media akan semakin rendah sehinggga akan mempengaruhi hasil
diameter zona hambat.

Kontrol negatif yang digunakan adalah aquadest karena tidak memiliki

efek sama sekali terhadap bakteri, pada kelompok kontrol positif dengan
ampicillin 10µ menunjukan rata-rata diameter zona hambat terbesar terhadap
pertumbuhan bakteri Escherchia coli. Media yang digunakan untuk uji aktivitas
adalah media NA (Nutrient Agar). Media NA merupakan suatu media yang
berbentuk padat, yang merupakan perpaduan antara bahan alamiah dan
senyawa-senyawa kimia. Komposisi dari NA adalah ekstrak daging, pepton dan
agar sebagai pemadat. Agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang
mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga
tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Ekstrak daging dan pepton
digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen,
vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk
tumbuh dan berkembang. Media Nutrient Agar (NA) merupakan medium yang
berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana medium ini
berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk
menumbuhkan bakteri.

Uji KHM merupakan salah satu uji yang digunakan untuk mengetahui
daya hambat minimum suatu zat bioaktif dalam menghambat pertanaman suatu
jenis bakteri uji. Konsentrasi hambat minimum dari zat bioaktif terhadap mikroba
digunakan untuk mengetahui sensitivitas dari mikroba terhadap zat bioaktif.
Nilai KHM berlawanan dengan sensitivitas mikroba yang diuji. Semakin rendah
nilai KHM dari sebuah zat aktif maka sensitivitas bakteri akan semakin besar.
Penentuan KHM dilakukan berdasarkan nilai kerapatan optik/Optical Density
(OD) yang berasal dari suspensi tiap-tiap bakteri uji dengan suatu metode serial
dilusi yakni akan membandingkan turbiditas/kekeruhan awal dan akhir sebuah
suspensi uji. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Adalah Konsentrasi Terendah
Senyawa Antimikroba Yang Dapat Menghambat Pertumbuhan Terlihat Dari
Mikroorganisme Setelah Inkubasi Semalam. Sedangkan pada penentuan KBM
ditandai dengan ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada media biakan. Dimana
nilai OD ≤ 60 (aktivitas antibakteri kuat), OD ≥ 60 (aktivitas antibakteri lemah).
VI. Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang diperoleh pada percobaan ini adalah sebagai
berikut:
1. Adanya aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan terbentuknya zona
hambat disekitar paper disc. Terbentuknya zona hambat menunjukkan
adanya indikasi aktivitas terhadap antibakteri
2. Uji KHM merupakan salah satu uji yang digunakan untuk mengetahui
daya hambat minimum suatu zat bioaktif dalam menghambat
pertanaman suatu jenis bakteri uji. Penentuan KBM ditandai dengan ada
tidaknya pertumbuhan bakteri pada media biakan
 DAFTAR PUSTAKA

Fitriah, Mappiratu, & Prismawiryanti. (2017). Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak

Daun Tanaman Johar (Cassia Siamea Lamk.) Dari Beberapa Tingkat
Kepolaran Pelarut. Jurnal Riset Kimia KOVALEN, 3(3) : 242-251.

Rollando. (2019). Senyawa antribakteri dari fungi endofit. Malang: CV. Seribu
Bintang.

Saputera, M. M., Marpaung, T. W., & Ayuchecaria, N. (2019). Konsentrasi Hambat

Minimum (Khm) Kadar Ekstrak Etanol Batang Bajakah Tampala
(Spatholobus Littoralis Hassk) Terhadap Bakteri Escherichia Coli Melalui
Metode Sumuran. Jurnal Ilmiah Manuntung , 5(2) : 167-173.