DNA Sequencing

1. Pengertian DNA Sequencing

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan
basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang
merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi
yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat
dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya. Hal
ini dilakukan dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah
diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan
seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.

2. Alat yang digunakan

- Applied biosystems prims 3100 ( capillary, 16 cappilaries)
- Applied biosystem prism 3700 (Capillary, 96 Cappilaries)
-
3. Metode yang digunakan.
Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA yaitu Metode
Maxam-Gilbert dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen
DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari
fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat
molekul DNA yang diperiksa. Teknik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid
pendenaturasi (denaturing polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-
molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat
memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel
pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan
seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan
dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua
untai molekul DNA.
1) Metode Maxam-Gilbert
Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA
didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang
digunakan .
2) Metode Sanger.
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu
dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing
berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis
untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika
ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut di running pada gel
electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA
dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah
(paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel
dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan
dNTP.
a. Dye Primers dengan Label Berbeda
Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur
saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle
sequencing.
Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih
mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna
berbeda
b. Dye-Terminators Sequencing
Para ilmuwan menemukan cara yang lebih simple untuk melabel ddNTP dengan 4 label
fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian,
reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan diputar pada satu lajur gel
electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.
Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan
secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus fosfat ujung 5’ bebas dari nukleotida baru
dengan gugus OH dari ujung 3’ rantai yang sedang memanjang proses ini berlangsung
sepanjang molekul DNA. Dideoksinukleotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung 3’nya,
melainkan gugus H. adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti, karena
ikatan difosfat tidak terbentuk. Pemanjangan rantai kan terhenti pada titik ini dan basa terakhir
diujung 3’ rantainya dalah sebuah terminator dideoksi. Modifikasi dari metode sanger ini
disebut dideoxy termination sequencing
Dalam metode pengurutan Sanger, digunakan empat campuran reaksi dalam
pengurutan fragmen DNA. Tiap campuran reaksi mengandung molekul DNA cetakan yang
akan diurutkan, primer yang telah diberi label dengan radioaktif, keempat macam
deoksinukleotida. DNA polymerase dan empat terminator dideoksi (ddATP, ddCTP, ddGTP,
atau ddTTP). Jika salah satu dari terminator ini digunakan pada untai DNA yang baru terbentuk,
maka sintesis untai baru ini akan terhenti; hasilnya adalah semua untai dengan panjang yang
bervariasi pada campuran reaksi akan berakhir dengan basa yang sama. Produk-produk
radioaktif tersebut akan dipisahkan dengan elektroforesis dan divisualisasikan melalui
 autoradiografi. Hasil autoradiografi dibaca dari bawah gel (fragmen terpendek yang berhenti
paling dekat dengan ujung 5’) kearah atas untuk mengetahui sekuens basa komplementer dari
untai cetakan.

4. Prinsip Kerja
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai
pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan
(template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip
dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini
dinamakan cycle sequencing. Berikut merupakan gambar dari proses cycle sequencing.

Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

1. Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti
PCR
2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan
menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan
dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA
cetakannya. Jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan
terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus
5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA
dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan
elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.