ANALISA PANGAN

ANALISA VITAMIN A METODE HPLC

DISUSUN OLEH :
ANGELA FIRDAUSA 115100100111012
ANNISAA RAMADHANI P 115100500111001
HANIFA RAHMAWATI 115100500111033
RATIH ANGGRAINI 115100500111023
MELIANA FEBRI YUSLINDA 115100501111005
JAZIMATUS SYARIFAH 115100501111007
TABHITA LARASATI 115100502111001
ATIKA RURI C 115100800111011
NURUL FAHMI RIZKIA 115100807111005


JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2013
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Pengertian HPLC
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran dimana cuplikan berkesetimbangan diantara dua fasa,yaitu fasa gerak dan
fasa diam. Fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasadiam yang menahan cuplikan
secara selektif. High Performance LiquidChromatography (HPLC) atau kromatografi
cair kinerja tinggi menggunakancairan sebagai fasa gerak dan fasa diamnya.
Kromatografi didasarkan atas distribusi partisi sampel (komponen)diantara fasa gerak
dan fasa diam. Fasa gerak yaitu fasa yang bergerak denganarah yang telah ditentukan.
Fasa gerak bergerak melalui fasa diam. Sedangkanfasa diam adalah fasa yang secara
tetap tidak bergerak. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit
berdasarkan kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan
terpisahberdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen dalam sampel, apakah
kepolarannya lebih mirip dengan fasa diam, maka dia akan tertinggal di fasa diam
atau bergerak lebih lambat, ataukah kepolarannya lebih mirip dengan fasa gerak
sehingga dia akan bergerak terdistribusi lebih jauh dan lebih cepat. Dengan bantuan
pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom detector. Cuplikan (sampel)
dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom
terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fasa diam, maka komponen tersebut akan keluar lebih lama.
Setiap campuran komponennya) yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan
kromatogram kromatografi gas, dimana jumlah peak menyatakan jumlah kompenen,
sedangkan luas peak meyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer
digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah
data hasil pengukuran. (Hendayana,2006)

Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus
kualitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel
dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan
untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C = Konsentrasi
X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan
dengan
menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.
Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC
adalah :
a. Kolom
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin
kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa
digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel
silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai
hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon
8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol.
Terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara
rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-
molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam
campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk
atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals.
Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada
dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-
senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat
dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat
melalui kolom.
Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom
C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu,
seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa
karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat
dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
b. Komposisi Eluen
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada
2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut
polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
c. Volume injeksi
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis
atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L). Injeksi sampel dapat dilakukan
melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling
value.
d. Detektor
Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik
kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding
kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul
sampel maupun fase gerak (bulk property detector).Detektor dapat dibedakan menjadi
:
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas
penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran
perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang
berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang
universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor
ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
Detektor tetapan dielektrika
Berdasarkan pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut
solute property detector).Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada
absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor
visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena
sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV
terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV
dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV
yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur.
Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada
254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang
gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan
detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga
gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
1.2 Vitamin A
Tumbuh-tumbuhan tidak mensintesis vitamin A, akan tetapi manusia dan
hewan mempunyai enzim di dalam mukosa usus yang sanggup merubah karotenoid
provitamin A menjadi vitamin A. Dikenal bentuk-bentuk vitamin A, yaitu bentuk
alkohol, dikenal sebagai retinol, bentuk aldehid disebut retinal, dan berbentuk asam,
yaitu asam retinoat.
Retinol dan retinal mudah dirusak oleh oksidasi terutama dalam keadaan
panas dan lembab dan bila berhubungan dengan mineral mikro atau dengan
lemak/minyak yang tengik. Retinol tidak akan berubah dalam gelap, sehingga bisa
disimpan dalam bentuk ampul, di tempat gelap, pada suhu di bawah nol. Retinol juga
sukar berubah, jika disimpan dalam tempat tertutup rapat, apalagi disediakan
antioksidan yang cocok. Vitamin dalam bentuk ester asetat atau palmitat bersifat
lebih stabil dibanding bentuk alkohol maupun aldehid.
Secara kimia, penambahan vitamin E dan antioksidan alami dari tanaman bisa
melindungi vitamin A dalam bahan makanan. Leguminosa tertentu, terutama kacang
kedele dan alfafa, mengandung enzim lipoksigenase yang bisa merusak karoten,
xantofil, bahkan vitamin A, melalui tahapan-tahapan oksidasi dengan asam lemak
tidak jenuh. Melalui pemanasan yang sempurna pada kacang kedele dan pengeringan
pada alfafa akan merusak enzim tersebut.
Di dalam praktek, terutama dalam penyimpanan, vitamin A bersifat tidak
stabil. Guna menciptakan kestabilannya, maka dapat diambil langkah-langkah, yaitu
secara kimia, dengan penambahan antioksidan dan secara mekanis dengan melapisi
tetesan-tetesan vitamin A dengan lemak stabil, gelatin atau lilin, sehingga merupakan
butiran-butiran kecil. Melalui teknik tersebut, maka sebagian besar vitamin A bisa
dilindungi dari kontak langsung dengan oksigen.












BAB II
METODOLOGI

2.1 Prinsip Pengujian Analisa Vitamin A dengan HPLC
Vitamin A (Retinol) ditentukan oleh kromatografi cair kinerja tinggi dengan
UV-deteksi setelah saponifikasi dan ekstraksi. Metode ini khususnya bermanfaat
untuk tablet yang mengandung sejumlah besar betacaroten dan produk yang
mengandung sejumlah kecil vitamin A.
2.2 Peralatan
Tekanan tinggi shimadzu kromatografi cair
Autoinjector SIL 10 A XL
CBM box 10 A
UV- Vis detector SPD 10A
Pump LC 10 AT
FVC 10 AL
atau menggunakan peralatan mirip HPLC
Grinding mill, Krups 75 or similar
Perkin Elmer model Lambda 20 UV/VIS Spectrophotometer or similar
2.3. Reagents
Potassium hydroxide e.g. Merck art. 5021
Ascorbic acid e.g. Merck art. 127
Sodium sulphate e.g. Merck art. 106649
Butylhydroxytoluen (BHT), e.g. Fluka art. 34750
Ether e.g. Superfos Kemi, art. 1416064
Ethanol (99%), e.g. DDSF
Nitrogen, e.g. D.I.B
1-pentanol = n-amylalcohol, e.g. Merck art. 975
Heptane e.g. Ratburn art. 1004
Milli-Q Water
Isopropanol = 2-propanol-R1, e.g. Merck art. 101040
Vitamin A e.g. Fe standard (= 160.000 mcg/g)
Diluted Sodium Hydroxide solution (2M) e.g. Baker art. 7067
Phenolphthalein solution R1 e.g. Merck art. 7233
Larutan kalium hidroksida (17M / 90%) digunakan untuk membubarkan 180 g
kalium hidroksida dalam 126 ml air.
Larutan natrium sulfat (3%) digunakan untuk melarutkan 30 g anhidrat natrium sulfat
dalam air dan encerkan dengan air untuk 1000 ml.
BHT-solution (0,1%), alkohol digunakan untuk melarutkan 1.0 g butylhydroxytoluen
dalam etanol dan encer dengan etanol untuk 1000 ml.
Sodium Askorbat solusi (2%) digunakan untuk melarutkan 3.5 g asam askorbat dalam
10 ml larutan diencerkan natrium hidroksida dan encerkan dengan air untuk 200 ml.
2.4 Chromatographic conditions
- B- 564, or
similar.
Mobile phase: Heptane : 1-propanol (99:1)
Flow rate: 2 ml/minute
Detection: UV-absorption 325 nm

Attenuation: App. 28 (8)
Chart Speed: App. 3 mm/minute
Run time: App. 12 minutes
Retention time: App. 7 minutes for Retinol
BAB III
PEMBAHASAN
3.1 Metode Perlakuan
3.1.1 Standar larutan
Beratnya, duplikat, sekitar 0.30 g standar dalam labu berbentuk kerucut.
Menggunakan A-asetat konsentrasi, Fe standar (= 160.000 mcg/g). Tambahkan 10 ml
sodium askorbat solusi (2%) dan panas di pemandian uap selama 5 menit.
Tambahkan 30 ml larutan BTH-(0.1%) dan 3 ml kalium hidroksida (17M).
Hubungkan termos kondensor AC dan refluks selama 30 menit pada mandi uap
(goyang sering). Setelah pendinginan, transfer solusi dengan 30 ml natrium sulfat 3%
dan 100 ml eter untuk di memisahkan saluran yang mengandung 100 ml eter.
Melanjutkan dari langkah ekstraksi.
3.1.2 Tes larutan
1. Cair, anhidrat solusi: mencampur sampel dan menimbang akurat sampel (= p g)
(Lihat tabel di bawah ini) ke dalam Erlenmeyer. Encer untuk 10 ml dengan sodium
askorbat solusi (2%).
2. Berminyak solusi: menimbang akurat jumlah sampel (= p g) (Lihat tabel di bawah
ini) ke 100 ml Erlenmeyer flask.
3. Tablet: tablet Pulverise 20 di sebuah pabrik penggilingan. Menimbang akurat
bubuk (= p g) (Lihat tabel di bawah ini) ke 100 ml Erlenmeyer flask. Tambahkan 10
ml sodium askorbat solusi (2%) dan panas di pemandian uap selama 5 menit dengan
sering gemetar. Vitamin A pekat dalam sampel.
3.2 Saponifikasi
Saponifikasi 8.2 tambahkan 30 ml alkohol bth-solution ( 0,1 % ) dan 3 ml
kalium hidroksida ( 17m ). Menghubungkan tulang termos dari udara kondensor dan
re-ketidakstabilan selama 30 menit di mandi uap ( goyang sering ).
Sejuk dan mentransfer dengan 30 ml dari natrium sulfat 3 % dan 100 ml eter untuk
sebuah 500 ml pisah mengandung 100 ml dari eter.
3.3 Ekstraksi
Goyang untuk 2 menit. Biarkan berdiri sampai lapisan yang jelas dipisahkan (
sekitar 30 menit ), dan melaksanakan lebih rendah aqueous lapisan ( jika emulsi
terbentuk, tambahkan beberapa tetes etanol 99 % ). Mencuci bagian eter ekstrak
dengan 4 x 50 ml merupakan air; goyang hati-hati dalam awal dalam rangka untuk
menghindari emulsification. Setelah itu menuangkan beberapa ml merupakan tahap
centrifuge air ke dalam sebuah tabung berisi beberapa tetes phenolphthalein-r1
Jika ini adalah merah - terus cuci sampai washings tidak lagi berwarna merah. Setelah
itu, pemindahan eter lapisan untuk sebuah 250 ml merupakan sebuah botol termos
atau volumetri round-bottom.
3.4 Persiapan Akhir
3.4.1 Tablet dan solusi
A + B: Transfer melalui sebuah plug kapas ditutupi dengan sulfat anhidrat natrium
oleh eter untuk labu alas bulat. Menguap dalam kekosongan dan encer dengan n-
heptane sampai kadar akhir 3-4 mcg/ml ditemukan.
C: transfer ke 250 ml volumetric flask dan mengisi volume dengan eter. 20.00 ml
dalam botol 50 ml dievaporasi di bawah uap nitrogen sampai 2 ml sisa yang tersisa.
Encerkan dengan n-heptane untuk volume akhir 50 ml.

3.5 Standart
Transfer oleh eter ke 250 ml volumetric flask (= STD A) dan mengisi volume
3.5.1 Penentuan konsentrasi uji Standar
Encerkan 2,00 ml STD A dengan 2-propanol untuk volume akhir 100 ml.
Ukur absorbansi pada 310, 325 dan 334 nm sesuai SOP QAM-10101.
Hitung penentuan uji.
3.5.2 Standar untuk HPLC
Encerkan 2,00 ml STD A dengan n-heptana ke volume akhir 100 ml.

3.6 Kromatografi
Transfer sampel dan standar botol dan menyuntikkan 100 ml dari solusi (ganda).
Catat daerah atau ketinggian puncak A-vitamin.
NB: Jauhkan air dari aparat.

3.7 Perhitungan



Keterangan :
a = yang diencerkan dalam jumlah ml ether untuk uji
At, As = daerah atau ketinggian puncak A-vitamin dalam kromatogram dari
standar dan larutan uji masing-masing
f = faktor pengenceran untuk pengujian
tw = rata tablet menimbang g
d = keseragaman d massa di g / ml
c = jumlah standar di g
S = uji standar dalam% (penentuan spektrofotometri)
F = faktor pengenceran untuk standar

3.8 Aplikasi analisa vitamin A metode HPLC


















DAFTAR PUSTAKA

Analytical Methods Committee. Determination of vitamin A in animal
feedinphfl by High 'Perfonance Liquid Ckromotography. Andy3 1985; 110 :
1026-1029

Direktorat Gizi Departernen Kesehatan FU. Dam komposisi bahm mdhnan.
Jakarta: Bharata, 1972

Dept. of Biochemistry and Biophysics. Assessment ofhttmun vitamin A status using
the relative dose rsponse (RDR) and modified relative dose response (MRDR)
Tests : Workshop and Training Course. Iowa State Univediy USA, 19..

Whitney, E.N; Evamay N. Hamilton and Sharon R RolZes.Understuncli'n.g
nutrition. New York: West Publishing Company, 1995

Yeum,K J et al. Human plasma cmtenoid response to the ingestion of controlled
diets high in@its and vegetables. ADLJ Clin nut^ 1996:64;5W2

Ohn, J . Dietary intervention In assessment and prevention of vitamin A
dejiciency