KIMIA ANALISI II

HPLC (High Performance Liquid

Chromatography )
 PENGERTIAN HPLC
• HPLC (High Performance Liquid
Chromatography atau Kromatografi Cair
Berperforma Tinggi) merupakan salah satu
teknik kromatografi untuk zat cair yang
biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
• HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap
zat padat tertentu.
 PRINSIP KERJA
• Pada prinsipnya kerja HPLC adalah pemisahan
analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam)
dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.
• Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda,
hal ini akan teramati pada spectrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
 LANJUTAN
• Hasil pemisahan tersebut kemudian akan
dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV,
fluorometer atau indeks bias) pada panjang
gelombang tertentu, hasil yang muncul dari
detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh
recorder yang biasanya dapat ditampilkan
menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung
online dengan alat HPLC tersebut.
 SISTEM PERALATAN HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas:
wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom,
detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau
perekam.
 Diagram skematik sistem
kromatografi cair seperti ini :
 LANJUTAN
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi.
2. Pompa
Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan.
 LANJUTAN
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara
langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di
bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat
dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
 LANJUTAN
4. Kolom dan Fase diam
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
5. Detektor HPLC
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut:
•Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
•Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
•Stabil dalam pengopersiannya.
•Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
•Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
Beberapa hal yang harus diperhatikan
agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
• Parameter percobaan sama antara standar dan
sampel
• Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel
dan standar yang sama
• Penentuan kadar dilakukan berdasarkan
hubungan (korelasi) dengan menggunakan
larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
• Berdasarkan area kromatogram
• Berdasarkan tinggi puncak kromatogram