Identifikasi pola kromatografi

dengan HPLC DAN UHPLC

Praktikum farmakognosi fitokimia 2
2021
Metabolite profiling
• Pemprofilan metabolit bertujuan untuk menentukan
karakteristik profil metabolit sekunder pada suatu
tumbuhan

Preparasi Akuisisi Pengolahan

sampel data data
TEHNIK IDENTIFIKASI

Kromatografi Cair

Kromatografi Gas/ GC-MS

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/ HPLC

Kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC)
• HPLC / High Performance Liquid Chromatography
• HPLC yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak
cairan dan fase diamnya cairan atau padat
• Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan setiap
komponen dalam sample (analit) berdasarkan
kepolarannya.
• Untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung
berapa konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif).
 Kegunaan umum HPLC :

Analisis Analisis senyawa

Pemisahan senyawa
ketidakmurnian tidak menguap
organik, anorganik
(impurities) (non-volatile)

Isolasi dan Penetapan kadar

Kontrol kualitas
pemurnian senyawa suatu senyawa
Dapat dilakukan otomatis Biayanya yang relatif mahal
Resolusi tinggi (puncak Masa kerja pendek
terpisah dengan baik) (berkaitan dengan umur
Pemisahan cepat dan efisien kolom)
Reproduksibilitas yang Pada laju alir yang tinggi
sangat baik dibutuhkan biaya yang besar
untuk pembelian dan
Preparasi sederhana pembuangan pelarut
berkemurnian tinggi.
KOMPONEN HPLC
Komponen HPLC
1. Wadah Fasa gerak
Wadah fasa gerak harus bersih dan inert.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel

Elusi dengan satu Elusi bertahap/ Step

eluen /Tehnik Gradient Polarity
Isokratis (SGP)
Komponen HPLC
3. Pompa
Pompa harus inert dan stabil
Fasa gerak yang paling sering digunakan adalah pelarut
polar yaitu campuran larutan buffer-metanol, campuran air-
metanol, atau campuran air-asetonitril.
4. Tempat penyuntikan,
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara
langsung, sedangkan ekstrak harus disaring terlebih dahulu
Komponen HPLC
3. Kolom dan Fasa diam
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hplc_kolom_jsw.jpg
Komponen HPLC
Tehnik Pemisahan
1. Pemisahan fase terbalik,
Fasa diamnya adalah C18 atau C8).
Fasa gerak yang paling sering digunakan adalah pelarut
polar yaitu campuran larutan buffer-metanol, campuran air-
metanol, atau campuran air-asetonitril.
2. Pemisahan pada fase normal,
Fasa diamnya adalah silika.
Fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi
atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol
UHPLC/ Ultra High Performance
Liquid Chromatography
Kromatografi cair berkinerja sangat tinggi
mencakup pemisahan LC menggunakan kolom yang
mengandung partikel dengan ukuran partikel yang kecil
(biasanya dibawah 2 mikrometer) yang dikemas dalam
kolom diameter yang kecil.
Manfaat menggunakan kolom yang mengandung partikel
yang lebih kecil (biasanya sub-2 μm) adalah efisiensi yang
lebih besar per satuan waktu
KEUNTUNGAN

• Waktu analisis yang dibutuhkan pada sistem UHPLC jauh

lebih singkat dibandingkan sistem HPLC konvensional.
Waktu analisis (runtime) yang lebih singkat ini akan
menyebabkan penggunaan eluen dan jumlah sampel yang
lebih sedikit sehingga akan meningkatkan efiensi sistem,
bahan, serta biaya
KEUNTUNGAN

• Adapun parameter LOD dan LOQ yang lebih kecil pada

sistem UHPLC menunjukkan bahwa metode UHPLC lebih
sensitif dibuktikan dengan adanya hasil kromatogram yang
lebih sempit, tajam, dan tinggi dibandingkan kromatogram
HPLC konvensional yang menghasilkan kromatogram yang
lebih lebar dan pendek.
KEKURANGAN

• Kerugian utama yang terjadi adalah umur kolom, selama

analisis tekanan tinggi dikembangkan karena ukuran
partikel. Menambah tekanan mengurangi masa pakai
kolom. Karena tekanan yang meningkat memerlukan lebih
banyak perawatan dan mengurangi umur kolom jenis ini
Remember…
Safety First!
TERIMA KASIH