HPLC

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

(KCKT) KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Member :
 Nabilah Urwatul
 Brendi
 Denny Bachtiar
 Ikhda Khullatil Mardliyah
 Fakhrun Nisa
 Zaenab Salsabila
HPLC/KCKT
 Teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis
dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada
sejumlah bidang, seperti: farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan.
 Dikembangkan tahun 1970-an dan digunakan untuk
pemisahan bagian analit-analit berdasarkan ukuran
polarnya. Namun, ada sedikit perbedaan pada alat ini,
yaitu kecepatan, ketelitian, dan kemampuannya
memisah-misahkan suatu campuran yang kompleks.
HPLC digunakan untuk analisis senyawa non volatile
termasuk sampel ionik dan polimerik.
HPLC sering digunakan untuk:
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti
asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-
protein dalam cairan fisiologis
2. Menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk
hasil samping proses sintesis atau produk-produk
degradasi dalam sediaan farmasi
3. Memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan
4. Memunikan senyawa dalam suatu campuran
5. Memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat
molekulnya dalam suatu campuran
6. Kontrol kualitas
Keterbatasan metode HPLC
1. Untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS)
2. Jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang
baik sulit diperoleh
Beberapa perkembangan HPLC terbaru
 Miniaturisasi sistem HPLC
 Penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat
 Analisis protein
 Analisis karbohidrat
 Analisis senyawa-senyawa kiral
Prinsip Kerja HPLC
 HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip
kromatografi (pemisahan) akibat adanya perbedaan kecepatan elusi
dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom
menuju detektor dengan bantuan pompa.
 Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara
penyuntikan.
 Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran
karena adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solute
terhadap fase diam.
 Solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar
dari kolom lebih dahulu dan sebaliknya, untuk solute yang kuat
berinteraksi dengan fase diam maka solute tersebut akan keluar
kolom dan dideteksi oleh detector pada panjang gelombang tertentu
lalu direkam menggunakan personal computer (PC) yang terhubung
online dengan alat HPLC tersebut dalam bentuk kromatografi gas.
 KOMPONEN HPLC

(5) (6)
(4)

(7)
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantar fase gerak
3. Alat untuk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Tabung penghubung
7. Komputer / integrator/ perekam

(3) (2)
(1)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------

WADAH FASE
GERAK
Menampung 1 sampai 2 liter pelarut untuk HPLC.
haruslah bersih dan lembab. Serta harus dilakukan
degassing sebelum pemakaian. Alat ini biasanya
berupa wadah pelarut kosong atau labu
laboratorium.

SISTEM PENGHANTARAN FASE GERAK

sebagai sistem penghantaran fase gerak dan fungsi
lainnya adalah memompa fase gerak ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan, reproducible, menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat
dan bebas gangguan. Syarat dari pompa ini haruslah inert
terhadap fase gerak. . Tekanan yang seharusnya diberikan
pada pompa adalah 5000 Psi dan mampu mengalirkan
fase gerak sebesar 3 mL/menit.
 FASE GERAK DALAM HPLC
Fase gerak biasanya terdiri dari campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut , polaritas
fase diam dan sifat komponen sampel.
 TABEL FASE GERAK PADA HPLC
PELARUT Parameter Parameter UV cutoff (nm)
kekuatan adsorpsi kekuatan partisi
N-heksana 0,01 0,1 195
Sikloheksana 0,04 -0,2 200
Triklorometan 0,40 4,1 245
Metilbenzen 0,29 2,4 285
THF 0,56 4,0 212
Propanon 0,82 3,9 330
Etanol 0,88 4,3 205
Metanol 0,95 5,1 205
Asetonitril 0,65 5,8 190
Air >1 10,2 170
INJEKTOR
Digunakan untuk memasukkan sampel . Bahan ini
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang
dilengkapi dengan keluk sample (sample loop) internal
atau eksternal.

KOLOM
disebut jantung kromatografi , karena menyangkut dengan
berhasil atau tidaknya analisis tergantung pada pemilihan
kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
Kolom umumnya terbuat dari stainlesteel dan dioperasikan
pada temperature kamar, terkadang juga digunakan dengan
suhu tinggi untuk kromatografi penukar ion dan
kromatografi eksklusi.
FASE DIAM/KOLOM
Fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi
secara kimiawi , silika yang tidak dimodifikasi atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen, yang berfungsi
sebagai penjerap.
contoh : oktadesil silika – C18 H35 (ODS)
oktil silika –C8H17
propil silika – C3H7
aminopropil – C3H6NH2
silika alfa, beta , gamma siklodekstrin.
KOMPUTER/ INTEGRATOR
Alat pengumpul data dihubungkan dengan
detector. Alat ini akan mengukur signal
elektronik ynag dihasilkan oleh detector lalu
memplotkannya sebagai suatu kromatogram
yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang
analis

DETEKTOR
Detector digunakan sebagai tempat lewatnya
komponen-komponen sampel yang terpisah secara
berturut-turut untuk nantinya akan ditemukan
jumlah kadarnya. Detector umumnya dibedakan
menjadi dua, yaitu detector universal dan detector
spesifik
JENIS DETEKTOR
 Detector Spektrofotometri UV-Vis
Cara kerja detector ini didasarkan pada adanya
penyerapan radiasi sinar ultraviolet (UV) dan sinar tampak
(Vis) pada kisaran panjang gelombang190-800 nm.

 Detector Photodiodite-array (PDA)

Detector PDA merupakan detector Uv-vis dengan
berbagai keistimewaan. Detector ini mampu
mengumpulkan kromatogram secara simultan pada
panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses.
 Detector indeks bias
Merupakan detector yang bersifat universal yang mampu
memberikan respon pada setiap zat terlarut. Dimana
detector ini kan memberikan respon pada setiap perbedaan
indeks bias antara analit dan pelarutnya.

 Detektor elektrokimia
Banyak senyawa organic dapat direduksi secara
elektrokimia pada elektroda yang cocok. Arus yang
dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat sehingga dapat
memberikan respon yang sesuai
SISTEM UMUM HPLC
Penggunaan untuk analisis kuantitatif
 Analisa kuantitatif adalah suatu analisa yang digunakan untuk mengetahui
kadar suatu zat . Analisa kuantitatif berkaitan dengan penetapan beberapa
banyak suatu zat tertentu yang terkandung dalam suatu sampel.
 Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran
luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas
atau area larutan standar.
Kegunaan umum HPLC adalah:
1. untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis ;
2. analisis ketidakmurnian (impurities);
3. analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile);
4. penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan
pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya
hampir sama;
5. pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements),
dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.
Dengan metode presentase tinggi/lebar
puncak
 Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau
tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti
bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan
sebagai suatu persentase dari total)
Metode Baku Luar (External Standard
Method)
 Pada metode ini kita membuat suatu Baku/ Standard yang
mengandung senyawa /senyawa-senyawa yang akan
ditetapkan kadarnya, idealnya jumlah baku sama dengan
jumlah bahan yang akan dianalisis, dan kita
membandingkan kromatogram baku dengan kromatogram
sampel.
Metode Baku Dalam (Internal Standard
Method)
 Dalam metode ini kita menambahkan ke dalam sampel
sejumlah tertentu (jumlah yang diketahui) Zat standar
(Baku Dalam). Kromatogram yang diperoleh
dibandingkan dengan kromatogram sampel atau campuran
senyawa dalam sampel.
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat
dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah :

 Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

 Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar
yang sama
 Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi)
dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu
retensi tertentu.
 Berdasarkan area kromatogram
 Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
 Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk
signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat
peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
 Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya
akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak.
Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap).
Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang
lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis.
 Link penggunaan hplc untuk analisis kuantitatif
 http://dwioktavia.wordpress.com/2011/04/14/hplc/
 http://tewewe.wordpress.com/2012/09/05/hplc/
SEKIAN DAN TERIMAKASIH
