 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) biasa disebut

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

dikembangkan pd tahun 1960-an dan awal tahun
1970-an
 HPLC merupakan teknik pemisahan berdasarkan pada

fase diam dan fase gerak, teknik pemisahan yg

diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian
senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi,
industri makanan.
1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis;
2. Analisis ketidakmurnian (impurities);
3. Analisis senyawa–senyawa tidak menguap;
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion (memiliki muatan positif dan negatif serta gugus
asam dan basa);
5. Isolasi dan pemurnian senyawa;
6. Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama;
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit
(trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala
proses indutri.
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, protein-protein dalam
cairan fisiologis;
2. Menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk-
produk degradasi dalam sediaan farmasi;
3. Memonitor sampel-sampel yang berasal dari
lingkungan;
4. Memurnikan senyawa dalam suatu campuran;
 Sulit untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dg spektrometer massa (MS)
 Jika sampel sangat kompleks, maka resolusi yg baik

sulit diperoleh
 Kromatografi merupakan teknik yg mana solut atau zat
terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi,
dikarenakan solut2 ini melewati suatu kolom
kromatografi
 Pemisahan solut diatur oleh distribusi solut dalam fase

gerak dan fase diam

 Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan
komponen pokok, yaitu :
(1) wadah fase gerak,
(2) sistem penghantaran fase gerak,
(3) alat untuk memasukkan sampel,
(4) kolom,
(5) detektor,
(6) wadah penampung buangan fase gerak,
(7) tabung penghubung, dan
(8) suatu komputer atau integrator atau perekam.
 Gradient
Controller
•
Pump Column
Detector
Injector
Mobile Phases
 Fase gerak cair dipompa dengan tekanan melewati kolom
(baja) yang mengandung fase diam dengan diameter 3-10µm.
 Analit dimasukkan ke dalam ujung kolom melalui loop valve
dan pemisahan campuran terjadi sesuai lamanya waktu yang
dibutuhkan komponen tersebut di dalam fase diam dan pada
saat yang bersamaan, komponen dalam campuran juga
menghabiskan waktu yang lebih lama / singkat di dalam fase
gerak dalam rangka melewati kolom.
 Monitoring komponen yang keluar (effluen) dari kolom dapat
dilakukan dengan beberapa macam detektor
 Fase gerak sebelum digunakan harus disaring dahulu
untuk menghindari partikel2 kecil
 Adanya partikel kecil dpt berkumpul dalam kolom

sehingga dapat menyumbat kolom kromatografi

 Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran

pelarut yg dpt bercampur secara keseluruhan

berperan dlm daya elusi dan resolusi
 Daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat

komponen sampel
 Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi meningkat dg meningkatnya
polaritas pelarut

 Untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari pada

fase gerak), kemampuan elusi menurun dg
meningkatnya polaritas pelarut.
 Elusi dpt digunakan dg cara isokratik (komposisi fase
gerak tetap sama selama elusi) atau dg cara bergradien
(komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)

 Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan

resolusi campuran yg kompleks terutama jika sampel
mempunyai polaritas yg luas

 Fase gerak yg paling sering digunakan untuk pemisahan

dg fase terbalik adalah campuran larutan buffer dg
metanol atau campuran air dg asetonitril
 Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara
langsung kedalam fase gerak yg mengalir dibawah
tekanan menuju kolom

 Menggunakan alat penyuntik yg terbuat dari tembaga

tahan karat dan katup teplon yg dilengkapi dg lekuk
sampel (sample loop) internal dan eksternal

 Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor

melewati lekuk sampel dan kelebihan dikeluarkan ke
pembuang
 Kebanyakan fase diam KCKT berupa silika yg
dimodifikasi secara kimiawi, silika yg tdk dimodifikasi
atau polimer stiren dan divinil benzen

 Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena

adanya residu gugus silanol (Si-OH)
 Silika dpt dimodifikasi secara kimiawi dg reagen2 spt
klorosilan
 Silika yg dimodifikasi mempunyai karakteristik

kromatografik dan selektifitas yg berbeda jika

dibandingkan dg silika yg tdk dimodifikasi

 Silika yg tdk dimodifikasi akan memberikan waktu

retensi yg bervariasi disebabkan adanya kandungan air
yg digunakan
 Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam
yg paling banyak digunakan krn mampu memisahkan
senyawa2 dg kepolaran yg rendah, sedang , maupun
tinggi
 Solut yg polar, terutama yg bersifat basa akan

memberikan puncak yg mengekor (tailing peak) pd

penggunaan fase diam silika fase terikat
 Metode KCKT merupakan metode yg sangat populer
untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam
bentuk sediaan atau dalam sampel hayati.

 Hal ini disebabkan karena KCKT merupakan metode

yang memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang
tinggi.
 Resolusi : Derajat pemisahan dua
tR2-tR1 2 (tR2-tR1)
komponen pada proses kromatografi , R = -------------- = -----------------
 Jarak antar dua puncak dibagi lebar 1/2 (W b1 + W b2) (W b1 + W b2)
alas puncak
 Syarat R ≥ 2
1. Detektor spektrofotometer →
paling banyak digunakan
 Yang mengabsorbsi sinar : sampel
bukan fase gerak → digunakan
sinar pada UV → detektor UV
 > konsentrasi sampel → absorban
tinggi > puncak tinggi
 Detektor UV sederhana panjang
gelombang = 254 nm
 Detektor > baik panjang gelombang

dapat diubah-ubah (190-700 nm)

2. Detektor indek bias

 Menggunakan refraktometer
diferensial
 Mengukur perbedaan indeks bias
fase-fase gerak dengan/ tanpa
sampel
 Tidak dapat untuk elusi gradien
3. Detektor fluorosensi

 Lebih peka dari kedua detektor

diatas
 Tetapi terbatas hanya untuk sampel
fluorosensi
TERIMA KASIH…..
 Analisis KCKT suatu formulasi obat dapat dilakukan
dengan standar eksternal dari obat yang ditetapkan.
 Luas area dari puncak analit yang ditetapkan kadarnya

dibandingkan dengan kurva baku yang dibuat

menggunakan seri konsentrasi larutan baku
pembanding dari analit.
 Penggunaan satu titik (satu konsentrasi) baku dapat
juga digunakan (terutama dalam kegiatan kontrol
kualitas)
 FDA menyarankan bahwa untuk analisis bahan aktif

dalam sediaan farmasi, kurva baku dibuat dalam

rentang ± 20% dari konsentrasi analit yang diharapkan
di dalam larutan sampel.
 Timbang seksama baku pembanding dari analit dan
dilarutkan sampai volume tertentu (larutan Stok)
 Buat seri konsentrasi baku dari larutan Stok dengan

catatan : akan diketahui rentang konsentrasi analit yang

akan dianalisis dan nantinya konsentrasi analit akan
berada di antara rentang konsentrasi baku ini)
 Injeksikan larutan baku ke alat KCKT (dimulai dari konsentrasi
terendah dan diakhiri dengan injeksi blanko fase gerak untuk
mengecek carryover)
 Siapkan sediaan farmasi untuk ekstraksi. Misalnya : serbuk
tablet, timbang seksama sejumlah tertentu
 Ekstraksi dengan pelarut yang menghasilkan recovery
ekstraksi yang baik dan tepatkan volumenya
 Saring jika dibutuhkan dan diambil sejumlah tertentu larutan
sampel dan dilakukan pengenceran (jika perlu) sampai
konsentrasinya jatuh di sekitar pertengahan seri konsentrasi
kurva baku
 Injeksikan larutan sampel hasil pengenceran ke alat KCKT.
Lakukan replikasi
 Buat plot hubungan seri konsentrasi baku dengan luas area.
Dapatkan persamaan kurva baku y = bx + a dan nilai koefisien
korelasinya (r) apakah memenuhi syarat linearitas atau tidak.
 Hitung konsentrasi larutan analit dengan memasukkan luas
area puncak analit dalam sampel ke dalam persamaan kurva
baku.
 Timbang 125 ± 10 mg paracetamol baku, dimasukkan ke dalam
labu takar 250 ml dan ditepatkan volumenya dengan asam
asetat (0,05M), dikocok homogen (Larutan Stok)
 Buat seri konsentrasi dari larutan stok (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 dan
2,5 mg/100 mL paracetamol)
 Timbang dan serbukkan 20 tablet sampel
 Timbang serbuk tablet setara dengan 125 ± 10 mg
paracetamol
 Campurkan serbuk yang ditimbang dengan asam asetat (0,05
M) selama 5 menit di dalam labu takar 250 ml, dan ditepatkan
sampai tanda dengan asam asetat 0,05 M
 Saring 50 ml larutan, sebanyak 25 ml filtrat dimasukkan ke
dalam labu takar 100 mL dan ditepatkan volumenya sampai
100 mL dengan asam asetat (0,05M)
 Ambil 10 mL larutan dan dipindahkan ke dalam labu takar 100
mL dan ditepatkan volumenya dengan asam asetat 0,05 M
 Analisis larutan sampel dan larutan baku dengan kondisi
kromatografi yang sama
 Bobot 20 tablet = 12,1891 g
 Bobot serbuk tablet yang diambil = 150, 5 mg
 Bobot paracetamol baku yang ditimbang = 126,1 mg
 Data kurva baku paracetamol :

Konsentrasi paracetamol Luas Area

baku mg/100 mL
0,5044 17.994
1,009 36.109
1,513 54.121
2,018 71.988
2,522 89.984
 Luas area larutan sampel = 45.205
 Hitung persentase kandungan paracetamol dalam serbuk
tablet yang dianalisis
 Kurva Baku Paracetamol :
 Substitusikan luas area puncak paracetamol larutan sampel ke
dalam persamaan kurva baku :
y = 35.656 x + 80
45.205 = 35.656 x + 80

Selesaikan persamaan di atas, menghasilkan konsentrasi dalam

mg/100 mL
Konsentrasi paracetamol dalam larutan sampel =
45.205 – 80 = 1,266 mg/100 mL
35.656
 Pengenceran :
25 ml  100 ml (4x pengenceran)
10 ml  100 ml (10x pengenceran)
Total pengenceran = 4 x 10 = 40 x
 Konsentrasi paracetamol dalam sampel awal sebelum
pengenceran = 1,266 mg/100 mL x faktor pengenceran
= 1,266 mg/100 mL x 40
= 50,64 mg/ 100 mL
 Jumlah paracetamol dalam larutan sampel sebelum diencerkan :
Volume larutan sampel sebelum diencerkan = 250 ml
Jumlah paracetamol dalam 100 ml larutan sampel = 50,64 mg
Jumlah paracetamol dalam 250 ml larutan sampel =
250 ml / 100 ml x 50,64 mg = 126,6 mg
Jumlah paracetamol dalam serbuk tablet yang dianalisis =
126,6 mg
 Jumlah paracetamol teoritis (yang diharapkan) dalam serbuk
tablet yang dianalisis :
Bobot 20 tablet = 12,1891 g
Bobot 1 tablet = 12,1891 g / 20 = 0,6094 g = 609,4 mg
Kadar paracetamol per tablet sesuai etiket = 500 mg
Jumlah paracetamol teoritis di dalam serbuk tablet yang
dianalisis = 150,5 / 609,4 x 500 mg = 123,5 mg
 Persen kadar
kadar paracetamol dalam tablet terhadap etiket =
126,6 / 123,5 x 100 % = 102,5 %
Kadar (mg/tablet)
= x (mg/100 mL) x Vol Pelarutan x F. Pengenceran x bobot rata-rata tablet
Bobot penimbangan

= 1,266 mg/100 mL x 250 ml x 40 x 609,4 mg/ tablet

150,5 mg
= 512,62 mg/tablet

Kadar (%) terhadap etiket = kadar mg/tablet x 100 %

kadar sesuai etiket
= 512,62 mg/tablet x 100 %
500 mg/tablet
= 102,5 %