METODE PEMISAHAN

KCKT/HPLC

Oleh :Apt. Gemmy Sarina, M.Farm

 KCKT/HPLC
 Dikembangkan pada akhir tahun
1960-an dan awal tahun 1970-an.
 KCKT  untuk pemisahan sejumlah
senyawa organic, anorganik, senyawa
biologis, analisis ketidakmurnian
(impuritis), senyawa non-volatile,
penentuan molekul2 netral, ionic
maupun zwitter ion, isolasi dan
pemurnian senyawa.
 KCKT/HPLC
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kimia
dan fisikokimia.
 KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, dimana teori dasarnya bukanlah
baru tetapi hasil pengembangan dari kromatografi cair kolom klasik.
 KCKT dapat dianggap sebagai pelengkap KG. Pada KG senyawa yang akan
dianalisis harus menguap atau dapat diubah menjadi senyawa yang menguap.
Sedangkan pada KCKT, analit harus larut dalam cairan (fase gerak).
 KCKT dapat digunakan untuk menganalisis senyawa organik dan anorganik
yang pada umumnya tidak dapat menguap.
 Kelebihan KCKT
 1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
 2. Mudah melaksanakannya
 3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
 4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
 5. Resolusi yang baik
 6. Dapat digunakan bermacam-macam detector
 7. Kolom dapat digunakan kembali
 8. Mudah melakukan “sample recovery”
 Keterbatasan KCKT
 Jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit
diperoleh.
 Dalam identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan
dengan spectrometer massa (MS).
Prinsip?????

Solut terpisah oleh perbedaan

kecepatan elusi pada kolom,
pemisahan ini diatur oleh
distribusi solut pada fase gerak
dan fase diam
 Sistem dan Instrumen KCKT
 Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu sub sistem pemisahan
dan sub sistem pendeteksian (detektor).
 Sistem pendeteksian terdiri dari detektor yang dihubungkan pada
ujung akhir kolom.
 Instrumen KCKT
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak
3. Alat untuk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Alat penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Komputer atau perekam
Skema instrument KCKT
1. Wadah fase gerak
 Harus bersih dan inert
2. Fase gerak
 Fese gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas)
 Pelarut yang digunakan dianjurkan HPLC grade.
 Sebelum digunakan disaring terlebih dahulu.
 Elusi dapat dilakukan secara isokratik dan gradien.
 Pelarut yg sering digunakan pd fase terbalik : campuran larutan buffer dengan
methanol atau campuran air dengan asetonitril.
 Fase normal : campuran pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi
atau pelarut2 jenis alkohol.
3. Pompa
 Harus inert terhadap fase gerak
 Bahan umum yg digunakan untuk pompa: gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.
 Laju aliran pelarut dalam kolom pada umumnya sekitar 1-3 mL/menit dengan tekanan
berkisar antara 500-6000 psi.
 Sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 3 mL/menit.
 Untuk preparative  mampu mengalirkan f.gerak 20 mL/menit.
 Jenis pompa yang dipakai antara lain pompa pneumatik, pompa pendesakan tetap dan
pompa torak dengan pendesakan bolak-balik (paling banyak digunakan).
4. Penyuntikan Sampel pada KCKT
 Alat penyuntik terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal.
 Pada awalnya sampel diinjeksikan langsung kedalam aliran pelarut
dengan semprit mikro melalui septum injektor menggunakan
diafragma atau tanpa diafragma.
 Volume suntik biasanya 10-50 μL.
5. Kolom
 Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari stainless steel dan Sebagian dari
gelas berdinding tebal.
 Kolom diisi dengan kemasan yang sesuai diperlukan untuk pemisahan tertentu.
 Kolom dapat dipanaskan sampai 60°C agar dihasilkan pemisahan yang lebih
efisien. Jika tidak dinyatakan lain, kolom dipertahankan pada suhu kamar.
 Ujung-ujung kolom dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau pipa
lainnya melalui fiting dan terminator dari pompa/injektor di ujung yang satu
dan pada ujung yang lain dihubungkan dengan detektor.
 Arah pengaliran fase gerak harus selalu sama.
Cont…
 Ada 2 jenis kolom pada KCKT
yaitu kolom konvensional dan
mikroboor.
6. Fase Diam
7. Detektor

 Detektor dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau pipa jenis
lainnya dengan ujung keluaran kolom.
 Jenis detektor yang dipakai untuk deteksi adalah detektor indeks bias,
ultraviolet sinar tampak, fluoresensi, elektrokimia dan spektrometri
massa.
 Pada umumnya, respon yang berasal dari detektor diperkuat dahulu
sebelum disampaikan pada alat perekam otomatis.
 Dapat pula respon ini dikirimkan kesuatu integrator digital elektronik
untuk mengukur luas puncak kromatogram secara otomatis.
Cont…
 Detektor dikelompokkan menjadi 2 : detector universal (indeks bias
dan spektrometri massa) dan spesifik (UV-Vis, fluoresensi &
elektrokimia).
 Jenis-Jenis KCKT
 Kromatografi Adsorbsi  disebut juga K. fasa normal
 Kromatografi Partisi  disebut juga K. fasa terbalik
 Kromatografi Fasa Terikat  paling banyak digunakan
 Kromatografi Penukar Ion  Teknik pemisahan campuran ion-ion
atau molekul2 yg dpt diionkan.
 Kromatografi Ekslusi Ukuran  pemisahan terjadi karena solute-
solute berdifusi masuk dan keluar pori-pori material paking kolom.
 Derivatisasi pada KCKT
 Reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat : produk yang dihasilkan
harus mampu menyerap baik sinar UV atau sinar tampak atau dapat
membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri
 Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar
mungkin (100%).
 Produk harus stabil
 Sisa pereaksi derivatisasi tidak boleh mengganggu pemisahan kromatografi.
 KCKT mode Isokratik Vs Gradien

 Kromatogram campuran 9 senyawa pada kolom

C-18, hasil simulasi menggunakan computer dari
Seraphin, ACS, USA. (A) mode isokratik
menggunakan fase gerak larutan 40% methanol
dalam air, (B) mode isoktarik menggunakan fase
gerak 90% methanol dalam air, dan (C) mode
gradien dengan komposisi awal fase gerak 40%
methanol dalam air dan komposisi akhir fase
gerak 90% methanol dalam air.
 Penerapan KCKT
 Analisis kualitatif
 Analisis kuantitatif
 Penerapan Kromatografi Partisi
 Fase diam biasanya : packing terikat fase terbalik dengan fase gerak
polar.
 Penerapannya sangat luas.
 K. Partisi terutama berguna untuk pemisahan homolog dan benzolog
yg berbeda berat molekulnya.
 Penerapan Kromatografi Adsorbsi
 Kelebihan kromatografi adsorbsi yang tidak dimiliki oleh metode
lain adalah kemampuan memisahkan campuran-campuran isomer.
Penerapan Kromatografi Penukar Ion
 Penerapan pada senyawa anorganik
 Penerapan pada senyawa organic dan biokimia
Penerapan Kromatografi Ekslusi Ukuran
 Dibagi menjadi K. filtrasi gel dan permease gel.
 Salah satu penggunaan metode ekslusi ukuran : pada pemisahan
molekul-molekul bahan alam dengan BM tinggi dari senyawa BM
rendah dan dari garam.
 Contoh penerapan permease gel : pemisahan homolog dan oligomer.
 Analisis Kuantitatif

1. Metoda Persentase Tinggi atau Lebar Puncak

Metoda ini disebut juga metoda normalisasi internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa
lebar atau tinggi puncak sebanding dengan kadar atau konsentrasi zat yang menghasilkan puncak.
Contoh :

Normalisai tinggi puncak

Puncak Tinggi Puncak
(%w/w)
1 12 12/162 × 100 = 7,4
2 27 27/162 × 100 = 16,7
3 72 72/162 × 100 = 44,4
4 51 51/162 × 100 = 31,5
  162 100
Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu :

 Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-
tiap komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada
kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi atau ditahan di dalam
kolom atau terelusi tanpa terdeteksi.
 Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respon detekor yang sama
untuk setiap komponen.
2.Metoda Baku Luar (External Standard Method)
Pada metoda ini kita membuat suatu baku atau standar yang mengandung
senyawa atau senyawa-senyawa yang akan ditetapkan kadarnya, idealnya
jumlah baku sama dengan jumlah bahan yang akan dianalisis, dan kita
membandingkan kromatogram baku dengan kromatogram sampel. Dan
kromatogram baku dapat dihitung suatu respon faktor untuk setiap puncak yang
diinginkan, respon faktor memberi informasi tentang konsetrasi komponen yang
dihasilkan oleh satuan respon detektor (unit detector respons) :

Kemudian untuk kromatogram sampel kita dapat menghitung konsentrasi dari

setiap komponen yang diinginkan dengan cara mengalikan tinggi atau lebar
puncak dengan respon faktor.
Contoh penetapan kadar benzoat dalam sirup dengan KCKT

Kolom : Zorbax 5 µ C – 18,25 x 4,6 cm

Fasa Gerak : CH3CN/0,005 mol dm-3 pH 4,5 dapar asetat (15:85)
Kecepatan Alir : 1,5 cm3 min-1; suhu 40°C
Detektor : UV absorpsi 254nm
Gambar menunjukkan beberapa hasil yang diperoleh pada penetapan kadar
benzoat yang ditambahkan sebagai suatu preservatif di dalam sirup. Kromatogram
adalah standar Natrium Benzoat (konsentrasi 0,07308 g dm-3 di dalam fasa
gerak), Kromatogram A adalah sirup (konsentrasi 90,6726 g dm-3 dalam fasa
gerak). Kedua Kromatogram direkam dengan sensitivitas detektor yang sama.
Lebar Puncak diukur menggunakan suatu integrator, yang mencetak (memprint)
angka proporsional antara konsentrasi dengan lebar Puncak. Waktu retensi
Benzoat pada sirup sama dengan waktu retensi Benzoat standar. Lebar Puncak
Benzoat yang diperoleh untuk :

standar 103 741 Sampel sirup 72859

Menghitung persentase (dalam berat) untuk benzoat preservatif di dalam sirup adalah :
73,08ppm
Respons Faktor = -----------
103741
= 7 044 x 10-4

Maka Konsentrasi Benzoat dalam sirup = 72859 x 7,044 x 10-4 = 51,32 ppm

Sebelum dianalisis sirup telah diencerkan dengan fasa gerak sampai 1000 ml, maka
konsentrasi benzoat sebenarnya adalah :
1000
51,32 x -------- = 566ppm = 0,0566%
906726
3. Metoda Baku Dalam (Internal Standard Method)
Dalam metoda ini kita menambahkan ke dalam sampel sejumlah tertentu (jumlah yang
diketahui) zat standar (baku dalam). Kromatogram yang diperoleh dibandingkan dengan
kromatogram sampel atau campuran senyawa dalam sampel.

Dari kromatogram standar dapat dihitung respons faktor relatif

sebagai berikut :
C/A
r = ------
Cs/As

R = respons faktor relatif

C = Konsentrasi Kornponen Sampel
A = Lebar atau Tinggi Puncak Komponen Sampel
Cs = Konsentrasi Baku Dalam
As = Lebar atau Tinggi Baku Dalam
Di dalam campuran sampel digunakan rumus berikut :
C’s
Cu = Au*r*-----
A’s
Cu = Konsentrasi komponen sampel
Au = Lebar atau Tinggi Puncak
C’s = Konsentrasi Baku Dalam
A’s = Lebar atau Tinggi Puncak Baku Dalam
Terima Kasih