BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang
tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika
dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit
atau campurannya kompleks.Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan
namun banyak diantara cara ini dapat digunakan untuk analisi kuatitatif. Jenis-jenis
kromatografi yang bermanfaat dalam analisi kualitatif dan analisis kuantitatif adalah
kromatografi kertas, kromatigrafi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas,
dan kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatografi kertas dan KLT pada umunya lebih
bermanfaat untuk tujuan indentifikasi, karena lebih mudah dan sederhana.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah penjelasan tentang analisa kromatografi ?

2. Apa sajakah jenis-jenis analisa kromatografi ?

1.3 Tujuan Masalah

1. Mengetahui penjelasan tentang analisa kromatografi

2. Mengetahui jenis-jenis analisa kromatografi
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Penjelasan Analisa Kromatografi

Kromatografi adalah proses pemisahan yang digunakan untuk memisahkan campuran

molekuler berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen dan distribusi molekul-
molekul dalam dua fasa diam (adsorben) dan fasa bergerak (eluen). Dengan perkataan lain
prinsip dasar dalam analisa kromatografi adalah berdasarkan pada prinsip distribusi fasa
yakni suatu perpindahan komponen-komponen zat yang dianalisa dari suatu fasa yang
bergerak (eluen) menuju ke fasa lain yang diam (adsorben) yang dilaluinya. Eluen adalah
pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam membawa komponen-
komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-
komponen senyawa yang akan dipisahkan. Sedangkan adsorben adalah fasa diam yang
mengikuti/menyerap zat yang dianalisa, contohnya kertas, kanji, selulosa, silika gel, dll.
Distribusi fasa atau perpindahan molekul suatu komponen dari fasa yang bergerak menuju ke
fasa diam yang dilaluinya merupakan suatu proses kesetimbangan. Apabila tetapan
kesetimbangan dari molekul komponen-komponen dari zat yang akan dianalisa terhadap ke
dua fasa yang bergerak dan fasa diam yang dilaluinya berbeda, maka akan terjadi pemisahan
komponen-komponen tersebut. Bila suatu komponen mempunyai daya ikat pada fasa diam
yang dilaluinya lebih besar, maka komponen tersebut akan lebih dahulu terikat/diadsorbsi
oleh fasa padat daripada komponen yang lainnya. Sebagai hasil analisa kromatografi, daerah
pemisahan komponen pada fasa diam akan berupa pita lurus. Distribusi molekul dapat berupa
distribusi fasa adsorbsi dan distribusi fasa partisi. Distribusi fasa adsorbsi yaitu distribusi fasa
yang terjadi karena adanya perbedaan daya adsorbsi komponen-komponen pada fasa padat.
Sedangkan distribusi fasa partisi yaitu distribusi fasa yang terjadi karena perbedaan kelarutan
komponen-komponen dalam pelarut-pelarut yang tidak saling melarutkan.

Kromatografi dapat digunakan untuk sebagai berikut :

1. Menentukan konsentrasi suatu zat sampel.

2. Menentukan kemurnian zat sampel.
3. Memisahkan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat.
 4. Menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat sampel dengan
menghitung harga Rf (Ratio formation) tiap komponen.

Rf = Jarak titik awal ke titik noda dibagi Jarak titik awal ke titik akhir pergerakan eluen.
Keakuratan hasil pemisahan dengan kromatografi bergantung pada beberapa faktor sebagai
berikut :

1. Pemilihan adsorben sebagai fasa diam.

2. Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai dengan fasa gerak.
3. Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material yang akan
dipisahkan.
4. Laju elusi atau aliran fasa gerak.

Analisa kromatografi dapat dibagi menjadi analisa kuantitatif dan analisa kualitatif.

2.2 Jenis-jenis Analisa Kromatografi

a. Analisis Kuantitatif

Analisis Kuantitatif yaitu menetukan jumlah (%) dari komponen-komponen yang

terpisah dari suatu cuplikan Metode kuantifikasi untuk analisis kuantitatif dengan
kromatografi ini dapat dilakukan dengan menggunakan metode baku eksternal, metode baku
internal, dan metode normalisasi interna' serta metode standar adist.

1)Metode baku eksternal

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak
diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan plot kalibrasi
menggunakan baku eksternal. Larutan-larutan baku ini dirujuk sebagai baku eksternal karena
larutan-larutan baku ini disiapkan dan dianalisis secara ter-pisah dari kromatogram senyawa
tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan
ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dalam sistem
kromatografi yang digunakan dan dianalsis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa
tersebut ditentukan dengan me-tode grafikdari kurva kalibrasi atau secara numerik.
 Gambar 1.10. Kurva baku untuk menghitung sampel dengan menggunakan baku eksternal.
S1, S2, dan S3 adalah standar eksternal untuk kalibrasi; dan U adalah sampel yang tidak
diketahui konsentrasinya"

Larutan baku (kadang-kadang disebut dengan kalibrator) disiapkan dengan

konsentrasi tertentu yang sudah diketahui (misal 0,1; 0,2; dan 0,3 mg/mL). Sejumlah tertentu
volume larutan ini diinjeksikan dan dianalisis lalu respon detektor (luas puncak atau tinggi
puncak) diplotkan terhadap konsentrasi sebagaimana dalam Gambar 1.10.

2. Metode baku internal

Baku internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit, meskipun demikian
senyawa ini harusterpisah dengan baikselama proses pemisahan. Baku internal dapat
menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel atau
konsentrasi karena variasi instrumen. Salah satu alasan utama digunakannya baku internal
adalahjika suatu sampel memeriukan perlakuan sampel yang sangat signifikan. Seringkali
perlakuan sampel memerlukan tahapan-tahapan yang meliputi derivatisasi, ekstraksi, filtrasi,
dan sebagainya, yang dapat mengakibatkan berkurangnya sampel. Jika baku internal
ditambahkan pada sampel sebelum dilakukan preparasi sampel, maka baku internal dapat
mengoreksi hilangnya sampel-sampel ini.
Syarat-syarat suatu senyawa dapat digunakan sebagai baku internal adalah: terpisah
dengan baik dari senyawa yang dituju atau dari puncak-puncak yang lain; mempunyai waktu
retensi yang hampir sama dengan analit; tidak terdapat dalam sampel; mempunyai kemiripan
sifat-sifat dengan analit dalam tahapan-tahapan penyiapan sampel; tidak mempunyai
kimiripan secara kimiawi dengan analit; tersedia dalam perdagangan dengan kemurnian yang
tinggi; stabil dan tidak reaktif dengan sampel atau dengan fase gerak; dan mempunyai respon
detektor yang hampir sama dengan analit pada konsentrasi yang digunakan.
Dengan metode baku internal, kurva baku dihasilkan dengan mempersiapkan
beberapa larutan baku yang mengandung konsentrasi yang berbeda dari senyawa yang dituju
dengan ditambah sejumlah konsentrasi tertentu yang tetap dari larutan baku internal. Sebagai
contoh penggunaan baku internal adalah penetapan kadar metomil dengan menggunakan
baku internal benzanilid (Gambar 1.11).
Kromatogram yang diberikan pada Gambar 1.11 menggam-barkan metodologi
standar internal. Di sini, metomil dikuantifikasi dengan menggunakan benzanilid sebagai
standar internal. Dengan menggunakan kurva kalibrasi, kandungan metomil yang tidak di-
ketahui dapat dicari dari rasio antara luas kromatogram metomil dibagi dengan luas
kromatogram benzanilid02'.

Gambar 1.11. Analisis metomil dengan metode standar internal:

(a) kromatogram; (b) kurva kalibrasi. 1 = benzanilid (standar internal); 2 = metil-N-
hidroksitioasetimidat; 3 =- metomil"3'.
Metode standar internal kurang sering digunakan dalam kromatografi cair dibanding
dalam kromatografi gas, karena pada kromatografi cair, injeksi secara berulang dapat
dilakukan dengan sistem injeksi yang teliti dan reliabel.

3. Normalisasi internal
Untuktujuan analisistertentu,hanyajumlah relatifanalitdalam suatu multikomponen
yang dibutuhkan. Hal ini dinormalisasi ke 100atau 1 dengan mengekspresikan jumlah relatif
masing-masing analit dalam suatu multikomponen sebagai persentase total (jika digunakan
normalisasi 100) atau fraksi (jika digunakan normalisasi 1). Normalisasi internal merupakan
nilai tertentu dalam kroma tografi untuktujuan kuantitatifyang mana beberapa sampel dapat
ditentukan secara bersama-sama dan konsentrasi absolut tidak di butuhkan. Untuk analisis
kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi puncak sebanding dengan konsentrasi atau
konsentrasi zat yang menghasilkan puncak. Dalam metode yang paling sederhana, diukur
lebar atau tinggi puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau
tinggi puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar
atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis.
Komposisi relatif dihitung dari respon alat, dan untuk kasus kromatografi digunakan
luas puncak masing-masing komponen dalam suatu campuran menggunakan rumus berikut:
%X1 = Ax / ∑ x 100%
Yang mana:
x, = salah satu komponen dari sebanyak n komponen
A = luas puncak atau respon lain yang terukur.
Ada dua hal yang harus diperhatikan jika menggunakan pendekatan ini untuk tujuan
analisis, yaitu: (i) kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-
tiap komponen muncul sebagai suatu puncakyang terpisah pada kromatogram. Hal ini
disebabkan komponen-komponen dalam suatu campuran dapat, berkoelusi. ditahan di dalam
kolom, atau terpisah secara sempurnatanpa terdeteksi, dan (ii) Rita harus mengasumsikan
bahwa Rita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen. Untuk
mengatasi kesulitan ini, maka diperlukan kalibrasi detektor.
Untuk menggunakan metode ini datam KCKT, beberapa kondisi harus dipenuhi:
semua analit yang berada dalam sampel yang akan dianalisis harus terelusi dari kolom (tidak
ada retensi yang bolak-balik), dengan resolusi yang cukup; dan lebih lanjut semua analit
harus terdeteksi. Semua koefisien respon harus diketahui, pa ling tidak diperoleh secara
eksperimental. Metode ini tidak dapat digunakan untuk menentukan persentase komponen
apapun da lam suatu campuran jika koefisien respon tidak ada. Pada sisi yang lain,
keuntungan metode ini adalah bahwa tidak diperlukan untuk mengetahui banyaknya sampel
yang diinjeksikan.

4. Metode standar adisi

Metode standar adisi merupakan teknik analisis kuantitatif yang mana serangkaian
sejumlah analit dengan jumlah yang telah diketahui ditambahkan ke dalam sampel.
Dengan menambahkan satu atau lebih alikuot standar, suatu kurva kalibrasi dapat disiapkan.
Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan dengan ekstrapolasi kurva kalibrasi
sebagaimana ditunjukkan oleh Gambar 1.12. Untuk mtode ini, respon analit hams linier di
kisaran konsentrasi yang digunakan dalam kurva kalibrasi. Suatu pendekatan praktik dalam
metode standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa bagian yang sama
lalu menambahkan ke dalamnya standar dengan level konsentrasi yang meningkat. Sampel
selanjutnya dianalisis dan respon versus konsentrasi akhir di-p/ot-kan. Konsentrasi akhir
standar adalah konsentrasi standar setelah ditambahkan pada sampel. Konsentrasi mula-mula
dalam sampel selanjutnya dilakukan dengan ekstrapolasi, padasumbu-x.

b. Analisis Kualitatif

Analisis kualitatif ialah Indentifikasi dari suatu komponen atau lebih dari suatu cuplikan. Ada
3 pendekatan untuk analisis kualitatif yakni:
1.Perbandingan antara data retensi solutyang tidakdiketahui dengan data retensi baku
yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama.

Untuk kromatografi planar (kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis), faktor
retardasi nilai R^ senyawa baku dan R^ senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan
cara dilakukan kromatografi secara bersama-sama untuk menghilangkan adanya variasi
kondisi bahan yang digunakan dan variasi laboratorium.
Untuk kromatografi yang menggunakan kolom (seperti KCKT dan KG), waktu
retensi (tp) atau volume retensi (V^) senyawa baku dan tp atau Vp senyawa yang tidak
diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara berurutan dalam kondisi alat yang
stabil dengan perbedaan waktu pengoperasian antar keduanya sekecil mungkin.

2.Dengan cara spiking.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, spiking dilakukan dengan menambah
sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku pada
kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara: pertama, dilakukan proses
kromatografi sampel yang tidak dispiking. Kedua, sampel yang telah dispiking dengan
senyawa baku dilakukan proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu yang diduga
mengandung senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah
dispiking dibandingkan dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak dilakukan spiking,
maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.
3.Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa.
Pada pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi gas dan dihubungkan
dengan detektor spektrometer massa, maka akan diperoleh informasi data spektra massa solut
dengan waktu retensi tertentu. Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan
spektra yang ada di database komputer atau diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan
untuk solut yang belum ada baku murninya.
Identifikasi dengan hanya menggunakan data retensi pada satu kondisi kromatografi
tidak selalu menghasilkan data yang reliabel. Oleh karena itu, perbandingan data dengan
menggunakan kondisi kromatografi yang berbeda (seperti fase diam atau fase gerak yang
digunakan berbeda) akan mengurangi kemungkinan identifikasi yang tidak be-nar.
 BAB III

KESIMPULAN

1. Prinsip dasar dalam analisa kromatografi adalah berdasarkan pada prinsip distribusi
fasa yakni suatu perpindahan komponen-komponen zat yang dianalisa dari suatu fasa
yang bergerak (eluen) menuju ke fasa lain yang diam (adsorben) yang dilaluinya.
Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam membawa
komponen-komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan
membawa komponen-komponen senyawa yang akan dipisahkan. Sedangkan adsorben
adalah fasa diam yang mengikuti/menyerap zat yang dianalisa, contohnya kertas,
kanji, selulosa, silika gel, dll.
2. Analisakuantitatifadalahmenetukanjumlah (%) darikomponen-komponen yang
terpisahdarisuatucuplikan
3. 4 Metodeanalisakuantitatif, yaituMetodebakueksternal, Metode baku internal,
Normalisasi internal, Metode standar adisi
4. Analisis
Kualitatifadalahuntukindentifikasidarisuatukomponenataulebihdarisuatucuplikan
5. MetodeanalisakualitatifPerbandingan antara data retensi solut yang tidak diketahui
dengan data retensi baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang
sama, dengan cara spiking, danMenggabungkan alat kromatografi dengan
spektrometer massa.
 DAFTAR PUSTAKA

Adnan, Mochamad. 1997. TeknikKromatografiuntukAnalisisBahanMakanan. Yogyakarta:

Andi Offset
Anonim.2010.Kromatografi
Gas.http://bondiebluesy.wordpress.com/2010/03/08/kromatografi-gas/.Di Akses 3
Juni 2012
SastrohamodjojoHarddjono Dr. Kromatografi.IPB Press. Bogor 1985
Soebagio, DrsDkk, Kimia Analitik II, Jica Common Textbook, Malang 2002
Underwood, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga Jakarta. 2004