ARTIKEL ILMIAH

PRAKTIKUM BIOKIMIA
“IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA SAMPEL
DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS”

Oleh,
NAMA : ANAK AGUNG SRI YONI
NIM : 1313031076
KELAS : VI C

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA
2016
 IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA SAMPEL DENGAN
MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS

Anak Agung Sri Yoni (1313031076)

Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Pendidikan Ganesha
Email: sriyoni27@gmail.com

ABSTRAK
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui perbandingan koefisien distribusi (R f) dari
berbagai asam amino dan untuk menentukan kandungan asam amino pada sampel melalui kromatografi
kertas dengan teknik ascending. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah metode kromatografi
kertas yang merupakan metode kualitatif. Hasil nilai Rf yang diperoleh dari percobaan ini yaitu dari asam
amino leusin, glisin, tirosin, triptofan, dan metionin dalam eluen fenol secara berturut-turut yaitu 1, 0,93,
0,95, 0,79, dan 0,94. Hasil nilai Rf dari asam amino leusin, glisin, tirosin, triptofan, dan metionin dalam
eluen campuran n-butanol, aquades dan asam asetat glasial secara berturut-turut yaitu: 0,79, 0,81, 0,71,
0,68 dan 0,88. Berdasarkan identifikasi perbandingan nilai Rf sampel dengan standar dan karakteristik
larutan sampel dan standar maka dapat diprediksi bahwa sampel unknown A mengandung asam amino
triptofan, sampel unknown B mengandung asam amino triptofan, metionin dan glisin, sampel unknown C
mengandung asam amino leusin dan tirosin.

Kata kunci : asam amino, identifikasi, kromatografi kertas, nilai Rf.

ABSTRACT
The purpose of this experiment is to determine the ratio of the distribution coefficient (Rf) of various
amino acids and to determine the amino acid content in the samples through ascending paper
chromatography techniques. The method used in this experiment is a paper chromatography method which
is a qualitative method. Rf value results obtained from these experiments are of the amino acid leucine,
glycine, tyrosine, tryptophan, and methionine in the eluent phenol in a row are 1, 0.93, 0.95, 0.79, and 0.94.
Results Rf value of the amino acid leucine, glycine, tyrosine, tryptophan, and methionine in the eluent
mixture n-butanol, distilled water and glacial acetic acid respectively are: 0.79, 0.81, 0.71, 0.68 and 0.88.
Based on the comparison of the value of Rf¬ sample identification with the standards and characteristics of
the sample solution and standard, it can be predicted that the unknown sample A contains the amino acid
tryptophan, an unknown sample B contains the amino acid tryptophan, methionine, and glycine, C unknown
samples containing amino acids leucine and tyrosine.

Keywords: amino acids, identification, paper chromatography, the value of Rf.

PENDAHULUAN mengakibatkan pergerakan diferensial dari

Pengaplikasian berbagai teknik
pemisahan dalam penelitian dilakukan untuk
dapat memisahkan sampel menjadi
komponen-komponennya. Pemisahan yang
paling sering digunakan dalam memisahkan
komponen penyusun suatu sampel adalah
kromatografi kertas.
Teknik pemisahan kromatografi ini
pertama kali diperkenalkan oleh Michael
Tswet (1906) seorang ahli botani dari Rusia.
Kromatografi berasal dari kata “chroma” dan
“graphein”. Dalam bahasa Yunani kedua
kata tersebut berarti “warna” dan “menulis”.
Pengertian kromatografi menyangkut metode
pemisahan yang didasarkan atas distribusi
diferensial komponen sampel diantara dua
fase, yaitu fase diam (stationary phase) dan
fase gerak (mobile phase). Fase gerak akan
membawa komponen yang dapat
komponen. Fase diam dapat berupa padatan
atau caquadesan yang terikat pada
permukaan padatan (kertas atau suatu
adsorben), sedangkan fase gerak dapat
berupa caquadesan yang disebut dengan
eluen atau pelarut, atau gas pembawa yang
inert. Gerakan fase gerak ini mengakibatkan
terjadinya migrasi diferensial komponen-
komponen dalam sampel (Tika,2010).
Pemisahan dengan metode
kromatografi memiliki kelebihan
dibandingkan dengan metode pemisahan
lainnya yaitu kromatografi dapat digunakan
untuk sampel atau konstituen yang sangat
kecil (semi mikro dan makro), cukup selektif
terutama untuk senyawa senyawa organik
multi komponen, proses pemisahan dapat
dilakukan dengan waktu yang relatif singkat,
harganya murah dan sederhana, karena
umumnya tidak memerlukan alat yang mahal
dan rumit (Soebagio, dkk., 2000).
Dalam kromatografi selalu terjadi
kecenderungan sebagai berikut: (a)
kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk melarut dalam caquadesan, (b)
kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk melekat pada permukaan padatan halus
(adsorpsi = penyerapan), (c) kecenderungan
molekul-molekul komponen untuk bereaksi
secara kimia (penukar ion), dan (d)
kecenderungan molekul-molekul tereklusi
pada pori-pori fase diam (Tika, 2010).
Kromatogarfi kertas merupakan
salah satu teknik kromatografi dengan bentuk
kromatografi yang paling sederhana, mudah
dan murah. Jenis kromatografi ini merupakan
bidang khusus kromatografi caquades-
caquades. Kromatografi kertas merupakan
salah satu jenis kromatografi yang memiliki
fase diam dan fase gerak berupa caquadesan
yang tidak saling bercampur. Fase diam
dalam kromatografi berupa aquades yang
terikat selulosa kertas sedangkan fase
geraknya berupa pelarut organik non polar.
Berdasarkan kedua hal itu kromatografi
kertas dapat digolongkan ke dalam
kromatografi partisi. Dalam kromatografi
kertas fase gerak akan merembes ke dalam
kertas karena efek kapiler. Rembesan fase
gerak pada kertas dapat dilakukan dengan
teknik menaik (ascending) atau dengan
teknik menurun (descending). Pada teknik
ascending rembesan fase gerak bergerak ke
atas sedangkan pada teknik descending
rembesan fase gerak bergerak ke bawah.
Pada teknik menurun rembesan fase gerak
disamping bergerak karena efek kapiler juga
dibantu oleh efek gravitasi sehingga
rembesan berjalan lebih cepat. (Soebagio,
dkk., 2000)
Kromatografi kertas digunakan untuk
pemisahan zat anorganik, organik, dan
biokimia dalam jumlah yang sedikit. Dalam
percobaan ini dilakukan analisis secara
kualitatif terhadap larutan yang mengandung
bermacam-macam asam amino.
Kromatografi kertas dapat dilakukan secara
satu dimensi atau dua dimensi. Apabila
macam komponen tidak terlalu banyak, maka
cara dua dimensi seringkali diperlukan.
Untuk itu diperlukan dua macam larutan
eluen, yang satu diperlukan untuk ke satu
arah, dan yang kedua diperlukan untuk ke
arah lain yang tegak lurus pada arah elusi,
setelah kromatografi kering. (Tika 2010)
Pelaksanaan pemisahan dengan metode
kromatografi kertas terbagi dalam tiga tahap
yaitu tahap penotolan cuplikan, tahap
pengembangan, dan tahap identifikasi. Pada
tahap penotolan kertas kromatografi yang
sudah disiapkan ditotolkan larutan cuplikan
dengan menggunakan mikropipet atau pipa
kapiler pada garis yang sudah dibuat. Pada
tahap pengembangan, ujung kertas
kromatografi yang dekat garis awal yang
telah berisi totolan cuplikan dicelupkan ke
dalam pelarut (eluen) yang terdapat dalam
bejana kromatografi. Komponen-komponen
cuplikan akan terbawa oleh rembesan
cuplikan. Perbedaan kelarutan komponen-
komponen cuplikan dalam eluen akan
mengakibatkan kecepatan bergerak
komponen-komponen dalam kertas juga
berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak
komponen-komponen ini lenih umum disebut
migrasi diferensial. Hasil pemisahan akan
nampak sebagai noda-noda berwarna pada
kertas dengan jarak yang berbeda-beda dari
awal. Pada tahap identifikasi atau
penampakan noda, jika noda sudah berwarna
dapat langsung diperiksa dan ditentukan Rf-
nya. Besaran Rf (rate of flow) menyatakan
derajat retensi suatu komponen dalam fase
diam. Rf juga disebut faktor referensi atau
faktor refensi ( Soebagio, 2000).
Setiap komponen memiliki harga Rf
tertentu. Jarak yang ditempuh oleh setiap
senyawa dari garis dasar relatif terhadap
jarak tempuh pelarut/eluen didefinisikan
sebagai Rf.
Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar
Nilai Rf dari suatu senyawa pada sistem
kromatografi kertas bergantung pada banyak
variabel, di antaranya sistem pelarut,
temperatur, lamanya elusi, dan jenis kertas.
Karena dipengaruhi oleh banyaknya variabel,
maka Rf suatu senyawa yang sudah diketahui
dijadikan standar atau patokan untuk
menentukan Rf senyawa lainnya.
Dalam praktikum ini dilakukan analisis
secara kualitatif terhadap larutan yang
mengandung bermacam-macam asam amino.
Pengamatan yang dilakukan cukup sulit
mengingat asam amino yang terlarut tidak
menunjukkan warna tertentu. Untuk
mengantisipasi hal tersebut, maka setelah
elusi dihentikan, posisi eluen ditandai dengan
pensil, lalu kromatogram dikeringkan dan
selanjutnya disemprot dengan larutan
ninhidrin. Ninhidrin akan bereaksi dengan
O O
H
OH
H2N C C
OH
(aq)
R
O O
O O
OH H H H
N N
OH (aq) H2 O
H (aq)
O O
Gambar 1. Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino
METODE
Alat dan bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan
ini adalah, 1 buah ruang kromatografi, 1
buah gelas kimia 250 mL, 1 buah gelas kimia
100 mL, 2 buah batang pengaduk, 1 buah
spatula, 1 buah penggaris, 1 buah gunting, 1
buah pinset, 1 buah pemanas listrik, 2 buah
pipet tetes, 1 buah corong pisah 250 mL serta
1 set statif dan klem. Bahan yang digunakan
dalam percobaan ini adalah 100 mL larutan
n-butanol, 24 mL asam asetat glasial, 2 mL
larutan glisin, 2 mL larutan triptofan, 2 mL
larutan leusin, 2 mL larutan tirosin, 2 mL
larutan metionin, masing-masing 2 mL
larutan unknown A, B dan C, 200 mL
aquades dan 100 mL fenol 2,5%
Prosedur Kerja
Pembuatan Larutan Eluen Campuran n-
Butanol, Asam Asetat Glasial dan Aquades
Sebanyak 100 mL larutan n-butanol
ditambahkan 100 mL aquades dan 24 mL
asam asetat glasial. Ketiga larutan tersebut
ditempatkan ke dalam corong pisah dan
dikocok. Kedua lapisan yang terbentuk
kemudian dipisahkan.
Penyiapan Kertas Kromatografi
Kertas kromatografi disiapkan dengan
ukuran yang disesuaikan dengan wadah
kromatografi. Pada bagian sekitar 1,5 cm dari
tepi bawah kertas ditandai dengan pensil.
asam amino menghasilkan senyawa
berwarna, umumnya berwarna cokelat dan
ungu, dengan reaksi sebagai berikut.
O OH
NH3(aq) CO2 RCHO
(g) (aq)
H
OH (aq) (aq)
O O
3H2O(l)
(aq) (aq)
O O
Proses Kromatografi dengan
Menggunakan Eluen Fenol
Kertas kromatografi dengan ukuran 15
x 25 cm ditotolkan dengan larutan leusin,
glisin, tirosin, triptofan, metionin, sampel A,
sampel B dan sampel C menggunakan pipet
kapiler. Jarak totolan antara satu dengan
yang lain adalah 1,5 cm. Perlu diperhatikan
tiap tetesan harus dikeringkan terlebih dahulu
dengan diangin-anginkan sebelum tetesan
berikutnya ditotolkan. Besar noda hendaknya
jangan melebihi 0,4 cm. Kertas dijaga bersih
dan sedapatnya tidak tersentuh jari.
Selanjutnya, kertas digantungkan dalam
ruang kromatografi selama beberapa jam
agar elusi dapat berjalan. Setelah larutan
elusi berjalan kurang lebih 10 cm dari batas
sampel, elusi dihentikan dan kertas
kromatografi dikeluarkan dari ruang
kromatografi. Kemudian, batas larutan
ditandai dengan pensil dan kertas
kromatografi dikeringkan pada suhu 100-
105oC. Setelah itu, kertas yang telah
dikeringkan disemprot dengan larutan
ninhidrin yang selanjutnya dikeringkan
kembali dalam oven. Kemudian, diukur jarak
eluen dengan jarak warna yang dibentuk.
Proses Kromatografi Dengan
Menggunakan Eluen Campuran N-
Butanol, Aquades dan Asam Asetat Glasial
Siapkan kertas kromatografi
dengan ukuran 15 x 25 cm dan
ditandai dengan pensil 1,5 cm dari
tepi bawah. Kemudian, dengan pipa
 kapiler ditotolkan larutan standar
asam amino dan sampel
berdampingan dengan jarak 1,5 cm.
Larutan ujung terletak 2 cm dari
pinggir kertas. Setelah itu, tiap-tiap
tetesan harus dikeringkan dulu,
misalnya dengan alat pengering
rambut. Haruslah diusahakan supaya
cukup asam amino ditempatkan pada
kertas tersebut. Sedangkan besar
noda hendaknya jangan melebihi
diameter 0,4 cm. hendaknya kertas
juga bersih dan sedapat mungkin
jangan disentuh oleh jari, gunakan
pinset. Karena diyakinkan ruang
kromatografi telah jenuh oleh uap
eluen. Kemudian kertas tersebut
digantungkan dalam ruang
kromatografi dan dicelupkan tepi
bawah kertas kromatografi dalam
eluen, usahakan jangan sampai
totolan asam amino standar dan
sampel terendam oleh eluen. Elusi
asam amino standar dan sampel kira-
kira eluen menempuh jarak 10 cm.
Elusi dihentikan dan ditandai jarak
yang ditempuh oleh eluen dengan
pensil. Kertas kromatografi
selanjutnya dikeringkan pada suhu
105-110oC. Kemudian kertas
disemprot dengan larutan ninhidrin
dan dikeringkan kembali pada suhu
105-110oC selama 5 menit. Noda-
noda asam amino yang akan terlihat.
Selanjutnya dapat dihitung harga Rf-
nya.
HASIL PENGAMATAN DAN
PEMBAHASAN
Percobaan ini menggunakan
teknik kromatografi kertas yang
didasarkan atas distribusi diferensial
komponen sampel diantara dua fase.
Dua fase yang dilibatkan dalam
kromatografi kertas terdiri dari fase
diam (stationary phase) dan fase
gerak (mobil phase). Praktikum
kromatografi kertas ini dilakukan
untuk menentukan asam amino yang
terdapat pada campuran asam amino
dengan membandingkan harga Rf
masing-masing asam amino yang
terdeteksi pada sampel dengan
standar. Teknik kromatografi kertas
yang digunakan adalah teknik
rembesan menaik (ascending). Pada
teknik ascending, campuran pelarut
(eluen) akan bermigrasi melewati
noda (spot) dengan arah ke atas.
Pada percobaan ini digunakan dua
eluen yaitu eluen fenol dan eluen
campuran n-butanol, asam asetat
glasial dan aquades.
Campuran eluen n-butanol,
asam asetat glasial, dan aquades
dibuat dengan mencampurkan ketiga
larutan tersebut ke dalam corong
pisah dan dikocok sehingga
terbentuk campuran yang berwarna
keruh. Setelah didiamkan terbentuk
dua lapisan. Lapisan atas berupa
caquadesan yang berwarna keruh,
dan lapisan bawah berupa
caquadesan bening tak berwarna
(gambar 2a). Terbentuknya dua
lapisan ini disebabkan karena ketiga
larutan tidak bercampur secara
sempurna. Hal ini disebabkan karena
aquades dan asam asetat dapat
bercampur secara sempurna
dikarenakan ke dua senyawa tersebut
adalah kovalen polar. Demikian juga,
dengan n-butanol dan asam asetat
dapat bercampur sempurna ke dua-
duanya sama-sama merupakan
senyawa organik. Sedangkan
aquades dan n-butanol hanya
bercampur sebagian sehingga ketika
campuran tersebut didiamkan setelah
dikocok, terlihat adanya dua lapisan.
Tujuan penambahan asam
asetat dalam pembuatan eluen ini
adalah untuk mendistribusikan kedua
pelarut yang tidak saling bercampur.
Larutan n-butanol dan aquades sama-
sama dapat terdistribusi dalam asam
asetat sehingga dengan penambahan
asam asetat glasial pada
perbandingan volume tertentu dapat
diperoleh campuran atau caquadesan
yang mengandung n-butanol, asam
asetat dan aquades. Pengocokan
dilakukan dengan tujuan untuk lebih
menyempurnakan distribusi antara
ketiga caquadesan tersebut. Dalam
hal ini, n-butanol sebagai pelarut
nonpolar bertindak sebagai fase
gerak, dan aquades (air) pelarut polar
bertindak sebagai fase diam.
 Aquades sebagai fase diam
umumnya terserap pada pori-pori
kertas. Oleh karena itu fase diam
bersifat polar. Molekul aquades
sebagai fase diam yang polar akan
terdistribusi pada permukaan kertas,
interaksi ini merupakan efek yang
sangat penting selama proses
kromatografi kertas. Molekul
aquades sebagai fase diam yang
teradsorpsi pada permukaan kertas
menghasilkan ribuan tetes kecil
sehingga memungkinkan aquades
bertindak sebagai fase diam. Fase
diam yang teradsorpsi akan dilewati
oleh fase gerak yaitu komponen non
polar dari eluen (n-butanol) atau
fenol (non polar). Hal ini
mengakibakan terjadi partisi atau
pemisahan campuran karena adanya
perbedaan distribusi asam amino
yang menyusun campuran asam
amino dalam fase gerak dan aquades
sebagai fase diam.
Kertas kromatografi yang
digunakan harus dijaga
kebersihannya, dihindarkan dari
kontak langsung dengan tangan
sehingga harus dipegang dengan
menggunakan penjepit atau
melengkapi tangan dengan
menggunakan slop tangan. Apabila
terjadi kontak langsung antara tangan
dengan kertas kromatografi maka
kemungkinan dapat mengganggu
proses kromatografi. Tangan
seringkali dalam keadaan lembab
karena mengeluarkan keringat
sebagai hasil pengeluaran dari tubuh
manusia. Keringat ini mengandung
minyak dan urea yang merupakan zat
organik sehingga kemungkinan
senyawa-senyawa organik tersebut
akan ikut bermigrasi sebagai fase
nonpolar (fase gerak). Hal inilah
yang nantinya akan dapat
mempengaruhi proses dan hasil dari
kromatografi.
Wadah kromatografi yang
akan digunakan terlebih dahulu harus
dijenuhkan dengan eluen. Pada tahap
pertama, wadah kromatografi
dijenuhkan dengan eluen fenol.
Proses penjenuhan dilakukan dengan
memasukkan eluen fenol ke dalam
wadah kromatografi dan ditutup.
Penjenuhan bertujuan untuk
mempersiapkan kondisi agar
kromatografi dapat berjalan lebih
cepat. Hal ini dikarenakan ketika
udara dalam kromatografi sudah
jenuh begitu pula dengan kertasnya
maka ketika elusi sampel dimulai,
eluen tersebut akan fokus bekerja
untuk mengelusi komponen sampel.
Penotolan asam amino dan
sampel pada kertas kromatografi
diameternya tidak melebihi 0,4 cm.
Apabila diameter totolan melebihi
0,4 cm, kemungkinan akan terjadi
perembesan dari fase gerak dan fase
diamnya sehingga menjadi tidak
jelas karena warna yang terdeteksi
terlalu menyebar dan mengganggu
hasil pengamatan sehingga sulit
untuk menghitung harga Rf-nya.
Kertas kromatografi yang digunakan
berisi larutan asam amino yang
terdiri dari larutan triptofan, leusin,
tirosin, glisin, sampel A, sampel B,
dan sampel C. Setiap menotolkan
larutan yang akan diuji, totolan
tersebut dikeringkan dengan cara
diangin-anginkan terlebih dahulu
kemudian dilanjutkan dengan
menotolkan kembali larutan asam
amino lain yang akan diuji.
Pada tahap pengembangan,
kertas kromatografi yang sudah
berisi larutan yang akan diuji
dimasukkan ke dalam wadah
kromatografi yang sudah dijenuhkan
dengan eluen fenol. Pencelupan
diusahakan tidak merendam totolan
asam amino dan sampel atau garis
awal (gambar 2b). Setelah kertas
kromatografi dicelupkan, eluen
langsung merembes melewati totolan
larutan yang diuji. Komponen-
komponen larutan yang diuji akan
terbawa oleh rembesan cuplikan.
Perbedaan kelarutan komponen-
komponen larutan yang diuji dalam
eluen akan mengakibatkan kecepatan
bergerak komponen-komponen
dalam kertas juga berbeda.
Perembesan dihentikan setelah eluen
hampir bergerak sekitar ±10 cm.
Setelah eluen bergerak bergerak
sekitar ±10 cm, kertas kromatografi
 dikeluarkan dari wadah apabila bereaksi dengan asam amino.
kromatografi. Namun, warna tidak langsung
Pada tahap identifiksi atau muncul ketika disemprotkan
penampakann noda, jarak tempuh ninhidrin karena diduga masih
eluen ditandai dengan pensil dan terdapat molekul-molekul aquades
kertas dikeringkan pada suhu 100- yang teradsorpsi sehingga ninhidrin
105oC. Hal ini dikarenakan pada tidak dapat bereaksi sempurna
suhu ini molekul aquades akan dengan asam amino yang
menguap. Setelah dikeringkan belum terdistribusi pada fase polar
ada penampakan noda sehingga (aquades) dan fase gerak (n-butanol).
untuk menampakan noda tersebut Untuk mengatasi hal tersebut, kertas
dilakukan penyemprotan kertas dikeringkan kembali di atas pemanas
dengan larutan ninhidrin. Tujuan listrik. Setelah kering, timbul warna
disemprotkan larutan ninhidrin pada berupa bercak-bercak ungu yang
kertas kromatografi untuk mengindikasikan adanya asam amino
memudahkan pengamatan karena (gambar 2c).
ninhidrin akan memberikan warna

(a) (b)
(c)
Gambar 2: (a) Campuran eluen n-butanol, asam asetat glasial, dan aquades dalam corong pisah,
(b) kertas kromatografi di dalam bejana kromatografi yang berisi eluen fenol, (c)
kertas kromatografi yang menggunakan eluen fenol.

Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dengan asam amino adalah sebagai berikut.
O O
H
OH O OH

H2N C C NH3(aq) CO2 RCHO

(g) (aq)
OH H
(aq) OH (aq) (aq)
R
O O

O O
O O
OH H H H
N N 3H2O(l)
OH (aq) H2 O (aq) (aq)
H (aq)
O O
O O
Gambar 3. Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino

Setelah timbul warna maka Rf dapat dihitung oleh setiap senyawa dari garis dasar relatif
sebagai jarak yang ditempuh asam amino terhadap jarak tempuh pelarut/eluen, dengan
berbanding dengan jarak yang ditempuh rumus sebagai berikut.
eluen. Rf merupakan jarak yang ditempuh
 Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar B, dan C dengan Rf standar yaitu dari larutan
Rf = asam amino triptofan, leusin, tirosin,
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar metionin dan glisin. Data hasil praktikum
Untuk mengidentifikasi jenis asam amino kromatografi kertas dengan menggunakan
apa saja yang terdapat pada sampel unknown eluen fenol serta nilai Rf nya adalah sebagai
A, B, dan C dapat dilakukan dengan berikut
membandingkan nilai Rf larutan sampel A,
Tabel 1. Data hasil kromatografi dengan eluen fenol
Asam Amino Jarak tempuh eluen (cm) Jarak Tempuh Komponen (cm) Rf
Leusin 11 11 1
Glisin 11 10,2 0,93
Tirosin 11 10,5 0,95
Triptofan 11 8,7 0,79
Metionin 11 10,4 0,94
Sampel Unknown 11 8,7 0,79
A
Sampel Unknown 11 8,8 0,80
B
11 10,4 0,94
11 10,2 0,93
Sampel Unknown 11 10,9 0,99
C 11 10,5 0,95
Asam amino yang ada pada sampel mendekati nilai Rf dari asam amino triptofan,
unknown dapat ditentukan menggunakan glisin, dan metionin sehingga sampel B
selisih Rf paling kecil yang merupakan asam diduga mengandung asam amino triptofan,
amino yang dimaksud. Berdasarkan data di glisin, dan metionin. Sampel C memiliki nilai
atas, dapat diketahui bahwa sampel A pada Rf mendekati nilai Rf dari asam amino tirosin
eluen fenol memiliki nilai Rf yang mendekati dan leusin sehingga sampel C diduga
triptofan. Bila dilihat dari selisih antara R f mengandung asam amino tirosin dan leusin.
sampel A dengan Rf dari larutan triptofan Adapun data selisih Rf Sampel Unknown
memiliki nilai nol sehingga sampel A diduga dengan Rf Standar pada Eleuen fenol sebagai
mengandung asam amino triptofan. berikut.
Selanjutnya nilai Rf dari sampel B

Tabel 2.Data Selisih Rf Sampel Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen fenol
Sampel Selisih Rf sampel dengan Rf asam Hasil
amino standar
Sampel Unknown A 0,79 - 0,79 0,00 (Triptofan)
Sampel Unknown B 0,80 - 0,79 0,01 (Triptofan)
0,93 - 0,93 0,00 (Glisin)
0,94 - 0,94 0,00 (Metionin)
Sampel Unknown C 1,00 - 0,99 0,01 (Leusin)
0,95 - 0,95 0,00 (Tirosin)

Percobaan yang kedua dilakukan tekniknya sama dengan kromatografi

kromatografi kertas dengan menggunakan
eluen campuran n-butanol, aquades, dan
asam asetat glasial. Pada eluen n-butanol
wadah kromatografi juga dilakukan
penjenuhan, dengan memasukkan eluen n-
butanol serta campurannya (gambar 4a).
Kromatografi menggunakan eluen n-butanol
menggunakan eluen fenol. Setelah proses
kromatografi selesai, kertas kromatografi
juga diperlakukan sama seperti kertas
kromatografi pada percobaan menggunakan
eluen fenol yaitu mengeringkan di atas
pemanas listrik dan setelah kering disemprot
dengan larutan ninhidrin. Kemudian
dikeringkan kembali di atas pemanas listrik. eluen dan jarak sampel masing-masing asam
Setelah dikeringkan timbul warna ungu amino serta sampel A,B, dan C yang terdapat
(gambar 4b), kemudian diukur jarak tempuh pada kertas kromatografi.

(a) (b)
Gambar 4: (a) kertas kromatografi di dalam bejana kromatografi yang berisi eluen campuran n-
butanol, aquades, dan asam asetat glasial, (b) timbul warna berupa bercak-bercak
coklat dan ungu pada kertas kromatografi dengan eluen berupa campuran n-butanol,
aquades, dan asam asetat glasial.

Jarak tempuh eluen dan larutan sampel masing kertas didapatkan data sebagai
setelah dilakukan pengukuran pada masing- berikut.

Tabel 3. Data hasil kromatografi dengan eluen n-butanol

Asam Amino Jarak Tempuh Eluen (cm) Jarak Tempuh Komponen (cm) Rf

Leusin 12 9,5 0,79

Glisin 12 9.7 0,81
Tirosin 12 8,5 0,71
Triptofan 12 8,2 0,68
Metionin 12 10,6 0,88
Sampel Unknown 12 8,2 0,68
A
Sampel Unknown 12 8,2 0,68
B
12 9.8 0,82
12 10,6 0,88
Sampel Unknown 12 9.5 0,79
C
12 8,4 0,7

Untuk mengetahui kandungan asam eluen campuran n-butanol, asam asetat

amino pada sampel dilakukan perhitungan
selisih nilai Rf sampel dengan nilai Rf
larutan asam amino standar pada eluen
campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan
aquades. Dalam menentukan asam amino
yang ada pada sampel unknown digunakan
selisih Rf paling kecil yang merupakan asam
amino yang dimaksud. Berdasarkan data di
atas,dapat diketahui bahwa sampel A pada
glasial, dan aquades memiliki nilai R f yang
mendekati triptofan. Bila dilihat dari selisih
antara Rf sampel A dengan Rf dari larutan
triptofan memiliki nilai nol sehingga sampel
A diduga mengandung asam amino triptofan.
Selanjutnya nilai Rf dari sampel B
mendekati nilai Rf dari asam amino triptofan,
metionin dan glisin sehingga sampel B
diduga mengandung asam amino triptofan,
metionin dan glisin. Kemudian nilai Rf dari tirosin. Adapun data selisih Rf Sampel
sampel C sama dengan nilai Rf dari asam Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen
amino leusin dan tirosin sehingga sampel C campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan
diduga mengandung asam amino leusin dan aquades sebagai berikut.

Tabel 4. Data Selisih Rf Sampel Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen n-butanol
Sampel Selisih Rf nilai Rf sampel Hasil
dengan asam amino standar
Sampel Unknown A 0,68 - 0,68 0,00 (Triptofan)
Sampel Unknown B 0,68 - 0,68 0,00 (Triptofan)
0,88 - 0,88 0,00 (Metionin)
0,82 - 0,81 0,02 (Glisin)
Sampel Unknown C 0,79 - 0,79 0,00 (Leusin)
0,71 – 0,70 0,01 (Tirosin)

Berdasarkan data yang didapatkan dalam eluen campuran n-butanol, aquades

pada kedua eluen yang berbeda, diperoleh
bahwa sampel unknown A mengandung
asam amino triptofan. Sampel B A mengandung asam amino triptofan, sampel
mengandung asam amino triptofan, metionin
dan glisin, sedangkan pada sampel C
mengandung asam amino tirosin dan leusin.
Namun, terdapat perbedaan Rf yang ada
dalam sampel unknown pada saat
menggunakan eluen fenol dan eluen
campuran n-butanol, asam asetat glasial,
serta aquades disebabkan karena eluen yang
belum terdistribusi secara maksimal sehingga
pemisahan belum terjadi secara sempurna.
Terjadi sentuhan atau gesekan antar
kromatogram ketika proses elusi, sehingga
berdampak pada kesulitan dalam
mengidentifikasi zat yang terkandung dalam
sampel. Selain itu juga karena ketidaktepatan
saat menotolkan larutan pada kertas
kromatografi yang seharusnya penotolan
larutan tidak melebihi diameter 0,4 cm.
Dengan demikian pada eluen fenol distribusi
noda asam amino yang terkandung pada
sampel unknown sulit untuk diidentifikasi.
Hal inilah menjadi penyebab perbedaan Rf
asam amino yang didapatkan pada sampel
unknown antara menggunakan elun fenol dan
eluen n-butanol.
SIMPULAN
Berdasarkan pembahasan di atas
dapat ditarik simpulan bahwa perbandingan
koefisien distribusi (Rf) dari asam amino
leusin, glisin, tirosin, triptofan, dan metionin
dalam eluen fenol berturut-turut adalah 1,
0,93, 0,95, 0,79, dan 0,94. Perbandingan
koefisien distribusi (Rf) dari asam amino
leusin, glisin, tirosin, triptofan, dan metionin
dan asam asetat glasial berturut-turut: 0,79,
0,81, 0,71, 0,68 dan 0,88. Sampel unknown
unknown B mengandung asam amino
triptofan, metionin dan glisin, dan sampel
unknown C mengandung asam amino tirosin
dan leusin.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih saya sampaikan kepada
dosen pengampu mata kuliah praktikum
biokimia Dr. I Nyoman Tika, M.Si. serta
asisten I Made Wirahadi Kusuma, I Nengah
Wiyadnya, dan Ayu Amardini atas
bimbingan dan masukan selama praktikum
identifikasi kandungan asam amino pada
sampel dengan menggunakan teknik
kromatografi kertas ini. Terima kasih juga
saya sampaikan kepada I Dewa Subamia
selaku laboran di Jurusan Pendidikan Kimia
atas bantuan dalam memberikan segala
keperluan yang berkaitan dengan praktikum
serta ucapan terimakasih kepada rekan
kelompok saya yang telah melakukan
percobaan bersama sehingga percobaan ini
dapat dilaksanakan dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II.
Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu
Pendidikan Negeri Singaraja.
Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun
Praktikum Biokimia. Singaraja :
Universitas Pendidikan Ganesha
Soebagio,dkk. 2000. Kimia Analitik II.
Malang:
Universitas Negeri Malang.
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum Ganesha
Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan