Tugas Makalah Enzimologi

Kelas Enzim: Oksidoreduktase

Alkohol Dehidrogenase

oleh:
Gaby Almira (10509028)
Masyitha Ambarwati (10509085)

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2012

Alkohol Dehidrogenase
Definisi
Alkohol dehidrogenase (ADH) termasuk kedalam kelas enzim
oksidoreduktase dengan sub- kelas dehidrogenase, dengan kode EC
1.1.1.1 (Nie, Xu, Mu, Wang, Yang, & Xiao, 2007). Alkohol dehidrogenase
mengkatalisis reaksi oksidasi alkohol primer dan sekunder menjadi
aldehid atau keton. Reaksi redoks ini melibatkan koenzim NAD + atau
NADP+ dan kofaktor PQQ. Reaksi kebalikannya juga dapat dikatalisis oleh
ADH.
Alkohol dehidrogenase terdapat pada hampir setiap organisme. Pada
manusia dan beberapa hewan, enzim ini berfungsi untuk mendegradasi
alkohol yang bersifat toksik. Alkohol dikonversi menjadi asetaldehid,
molekul yang lebih toksik lagi. Namun asetaldehid dengan cepat diubah
menjaid asetat dan molekul lain yang dapat dianfaatkan oleh tubuh kita.
Pada manusia dan hewan, ADH paling banyak dihasilkan di hati dan
lambung. Pada ragi, tanaman, dan bakteri, alkohol dehidrogenase
mengkatalisis reaksi kebalikannya, yaitu mensintesis alkohol sebagai
bagian dari proses fermentasi. Enzim ADH yang paling aktif adalah yang
berasal dari ragi.
Struktur alkohol dehidrogenase pada manusia:

Alkohol
dehidrogenase pada manusia berbentuk dimer dengan berat molekul 80
kDa.

Reaksi yang dikatalisis alkohol dehidrogenase pada manusia adalah

sebagai berikut:

CH3CH2
H
+
+
NAD
CH3CH

O
+ NAD
+ H+

Data berikut adalah data

Saccharomyces cerevisiae.

alkohol

dehidrogenase

pada

ragi

roti,

Alkohol dehidrogenase adalah tetramer dengan masing-masing subunit

mengandung satu atom zinc (Vallee and Hoch, 1955). Pada tiap subunit,
ada dua sisik aktif gugus sulfidril yang berjauhan. Kedua gugus ini dapat
dibedakan berdasarkan reaktivitasnya terhadap iodoasetat dan butil
isosianat (Twu, Chin, and Wold, 1973). Residu histidin memiliki peranan
penting dalam sisi aktif (Dickenson and Dickinson 1975 and LeBrun et al.,
2004).
Struktur alkohol dehidrogenase pada ragi:

Berat molekuler: 149.5 kDa

pH optimum: 5.4 (Shore and Theorell, 1966)
Titik isoelektrik: 6.91 (teoretis)
Koefisien ekstingsi: 41,170 cm-1 M-1
Aktivator:

Inhibitor:

reagen peangaktivasi sulfidril

logam berat dan reagen -SH

merkaptoetanol

tiourea

ditiotreitol

turunan purin dan pirimidin

sistein

kloroetanol dan fluoroetanol

agen pengkelat logam berat

N-alkilmaleimida

iodoasetamida

1,10-fenantrolin

8-hidroksiquinolin

analog beta-NAD

(White and White 1997)

ADH pada bakteri dan ragi akan memfermentasikan glukosa menjadi

etanol dan CO2. Sesuai dengan reaksi berikut:
Glukosa + 2 ADP + 2 Pi 2 ethanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
Glukosa melalui proses glikolisis akan menghasilkan piruvat yang
kemudian diubah menjadi asetaldehid dan CO2. Asetaldehid inilah yang
diubah oleh alkohol dehidrogenase menjadi etanol. Varian ADH yang
berperan dalam proses ini adalah ADH1. Proses fermentasi dari glukosa
menjadi etanol ini adalah untuk meregenerasi NAD+.

Mekanisme kerja ADH pada manusia

Tahapan:
1. pengikatan koenzim NAD+ pada enzim
2. pengikatan substrat alkohol melalui koordinasi dengan zinc
3. deprotonasi His-51

4. deprotonasi nikotinamida ribosa

5. deprotonasi Ser-48
6. deprotonasi alkohol
7. transfer hidrida dari ion alkoksida kepada NAD + menjadi NADH, dan
zinc terikat pada aldehid atau keton
8. pelepasan produk aldehid atau keton
Tahapan ini diperoleh dari studi kinetika. Mekanisme yang terjadi pada
ragi atau bakteri adalah kebalikannya.

Regulasi Gen
Tujuh gen untuk Saccharomyces cerevisiae
telah diidentifikasi
(Lertwattanasakul et al., 2007). ScADH1 mengkode enzim fermentatif
yang memproduksi etanol (Bennetzen dan Hall, 1982). ScADH1
diekspresikan dalam jumlah banyak dengan kehadiran glukosa. ScADH2
mengkode isozim yang mengubah etanol menjadi asetaldehid (Ciriacy,
1975; Wills dan Jornvall, 1979; serta Russel dan Hall, 1983). ScADH2
diregulasi secara negatif dengan kehadiran glukosa. Gen ScADH3 ditekan
jumlahnya degnan kehadiran glukosa dan protein pada mitokondria
(Young dan Pilgrim, 1985). ScADH4, ScADH5, and ScADH6 mengkode
protein ScADH4, ScADH5, and ScADH6. ScADH6 and ScADH7 diduga
berkontribusi dalam menyeimbangkan jumlah NADP+/NADPH (Larroy et
al., 2002).
Tabel 1. Variasi Alkohol Dehidrogenase Pada Manusia
Kelas
Nama Resmi Gen
Nama LamaNama Lain

Urutan

Protein

ADH1A

ADH1

ADH1A

NM_000667

ADH1B

ADH2

ADH1B

NM_000668

ADH1C

ADH3

ADH1C

NM_000669

II

ADH4

ADH4

ADH2

NM_000670

III

ADH5

ADH5

ADH3

NM_000671

ADH6

ADH6

ADH5

NM_000672

ADH6

IV

ADH7

ADH7

ADH4

NM_000673

Adanya variasi jenis ADH menyebabkan bervariasinya laju

metabolisme alkohol di dalam hati. Berdasarkan properti kinetik inilah
maka kemampuan hati seseorang dalam mengoksidasi alkohol dapat
diamati. Aktivitas alkohol dehidrogenase akan bervariasi antara pria dan
wanita, tua dan muda, serta kondisi lingkungan (Edenberg, 2007).

Isolasi
a) Mengisolasi ADH dari Hati Manusia atau Hewan
2-5 gram hati manusia yang telah meninggal (12 jam) dihomogenisasi
dalam 2-5 mL natrium fosfat 50 mM (pH 7,5) pada suhu 4C. Homogenat
kemudian disentrifugasi selama 60 menit dengan kecepatan 10.000 x g.
Supernatan kemudian digunakan untuk karakterisasi.
b) Mengisolasi ADH dari Bakteri
1) Cloning Gen Pengkode Alkohol Dehidrogenase
Urutan basa nitrogen pengkode alkohol dehidrogenase (adhD) disesuaikan
dengan basis data yang telah ada. Gen tersebut kemudian diperbanyak
dengan menggunakan PCR dengan primer yang sesuai. Gen-gen yang
telah diperbanyak kemudian dimurnikan dan dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi. Potongan ini kemudian disambungkan
dengan vektor kemudian diinsersikan ke dalam sel inang (E.coli) untuk
diperbanyak. Kemudian vektor hasil perbanyakan melalui kloning diisolasi
kemudian
ditempelkan
pada
vektor
ekspresi
untuk
kemudia
ditransformasikan ke dalam sel inang. (Machielsen, 2006)
2) Produksi dan Pemurnian
Sel inang yang mengandung vektor ekspresi kemudian diinokulasi ke
dalam media LB cair. Sel diinkubasi overnight pada shaker. Kemudian
dilakukan scale-up sehingga diperoleh kultur dalam jumlah yang lebih
besar. Kultur di-induce dengan menggunakan IPTG, kemudian diinkubasi
kembali. Sel kemudian dipanen, dilarutkan kembali dengan menggunakan
Tris-HCl buffer dan diberi tekanan. Crude extract kemudian disentrifugasi
selama 20 menit dengan kecepatan 10,000 x g. Supernatan yang
dihasilkan digunakan untuk karakterisasi. Proses pemurnian dapat
dilakukan menggunakan metode kolom kromatografi (Machielsen, 2006)
c) Mengisolasi ADH dari Ragi
Sel ragi sebanyak 100dian ditambahkan 2mM -mercaptoetanol, dan glass
beads. Sel dihancurkan dengan menggunakan vortex. Sampel kemudian
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12,000 rpm. Supernatant
kemudian digunakan untuk proses karakterisasi (Zanon, 2006).

Karakterisasi
a) Penentuan Massa Molekular
Penentuan massa molekular dapat dilakukan dengan size exclusion
chromatography. Enzim di dalam buffer disuntikkan ke dalam kolom. Larutan
standar yang dapat digunakan adalah aldolase (158 kDa), BSA (67 kDa),
ovalbumin (43 kDa), kimotripsinogen (25 kDA), dan Rnase (13,7 kDa). Selain

itu dapat digunakan SDS PAGE. Massa molekul dari alkohol dehidrogenase
adalah 80 kDa (Edenberg, 2007).
b) Penentuan Aktivitas Enzim
Kecepatan proses reduksi-oksidasi ditentukan dengan metode kolorimetri.
Proses oksidasi ditentukan dengan menambahkan alkohol, NAD + dan glisin.
Sedangkan untuk proses reduksi ditentukan dengan menambahkan buffer,
aldehid/keton, dan NADH. BSA digunakan sebagai standar (Machielsen,
2006).
c) Penentuan Suhu Optimum
Alkohol dehidrogenase ditambahkan dengan buffer glisin pada pH 8,8
kemudian ditambahkan substrat. Laju aktivitas enzim diukur pada rentang
suhu 30-100C. Suhu optimum alkohol dehidrogenase adalah 70C
(Machielsen, 2006).
d) Penentuan pH Optimum
pH optimum ditentukan dengan cara enzim dilarutkan ke dalam buffer
dengan beragam rentang pH. Kemudian ditentukan aktivitas enzim tersebut.
pH optimum alkohol dehidrogenase adalah 6,1-8,8. (Nie, Xu, Mu, Wang, Yang,
& Xiao, 2007)
e) Penentuan Parameter Kinetik
Parameter kinetik ditentukan melalui persamaan Michaelis-Menten sesuai
dengan uji aktivitas yang telah dilakukan.

f) Penentuan Pengaruh Penambahan Garam, Logam, dan Inhibitor

Ke dalam enzim alkohol dehidrogenase ditambahkan beberapa jenis garam
(K+, Mg2+, Mn 2+, Na+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Li2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Ca2+) serta
inhibitor seperti EDTA. Aktivitas enzim kemudian diukur. Alkohol
dehidrogenase mampu terstabilkan oleh ion logam monovalen dan divalen
kecuali Cu2+. (Nie, Xu, Mu, Wang, Yang, & Xiao, 2007)

Aplikasi

pembuatan alkohol
Pada awal perkembangannya, bioteknologi sangat identik dengan
bisnis fermentasi alkohol. Ragi dan bakteri memiliki alkohol
dehidrogenase yang berukuran besar. Gula didegradasi untuk
menghasilkan energi, dan produk sampingnya adalah alkohol, yang
diekskresikan keluar sel. Fermentasi banyak dipakai untuk
memproduksi minuman beralkohol seperti bir dan wine.

biokatalis

Secara umum, enzim sebagai biokatalis memiliki keuntungan, yaitu

bersifat selektif, tidak menghasilkan produk samping, dan umumnya
bekerja optimum pada suhu dan tekanan yang tidak terlalu tinggi
sehingga mengurangi penggunaan bahan bakar fosil. Karena itu, enzim
dipandang lebih menguntungkan dari sisi ekonomis maupun
lingkungan dibandingkan katalis konvensional.
Alkohol dehidrogenase mampu mengubah gugus karbonil menjadi
alkohol yang optis murni. Karena itu, dehidrogenase adalah katalis
yang sangat penting dalam sintesis organik. Banyak pengembangan
yang difokuskan untuk menemukan biokatalis yang dapat
menghasilkan stereospesivitas yang sesuai untuk keperluan industri.
Dewasa ini, senyawa kiral adalah komponen paling penting dalam
industri kimia dan farmasetika untuk produksi katalis kimia, liquid
crystal, perasa, agrokimia, dan obat (Daubmann et al., 2006). Alkohol
sekunder yang optis aktif banyak digunakan sebagai intermediet
dalam pengenalan informasi kiral pada produk. Biokatalis ini dapat
digunakan sebagai enzim yang sudah diisolasi atau masih dalam whole
cell. ADH mengkatalisis reduksi stereoselektif keton prokiral dengan
kemoselektivitas, regioselektivitas, dan stereoselektivitas yang
mengagumkan (Wandrey, 2004).
Contoh farmasetika dengan intermediet alkohol kiral adalah obat
antihipertensif, obat penyumbat kanal kalsium dan kalium, agen
antiaritmik, agonis -reseptor, obat antikolesterol, dan obat antiviral.
Reaksi ini membutuhkan kofaktor NADH dan NADPH.
Pada salah satu penelitian, bioreduksi enansioselektif untuk senyawa
obat pentoksifilin (PTX), propentofilin (PPT), dan denbufilin (DBF),
menggunakan (R)-alcohol dehidrogenase dari L. kefir, (S)-aromatic
alcohol dehidrogenase dari Thermoanaerobium sp. dan (S)-alcohol
dehydrogenase dari Thermoanaerobium brockii. Setiap obat ini
memiliki gugus metil keton pada strukturnya, yang kemudian akan
direduksi secara biokatalitik oleh ADH.
Contoh pentingnya kiralitas pada senyawa-senyawa obat ini diberikan
sebagai berikut. Metabolit (R)-hidroksi dari PTX ((R)-OHPTX), dikenal
sebagai lisofilin, adalah kandidat obat
untuk sindrom distress
pernafpasan akut, luka paru-paru akut, septic shock, dan mukositis,
serta efektif dalam pencegahan dan pengobatan diabetes tipe I.
Sedangkan
enansiomernya,
((S)-OHPTX)
tidak
aktif
secara
farmakologis.

Jalur bioreduksi xantin dengan gugus metil alkil keton

Hasilnya adalah sebagai berikut: Semua ADH yang diuji menunjukkan
aktivitas enansioselektif (ee 99100%), namun hanya biokonversi LKADH
yang memuaskan, yaitu dalam rentang 96-86%. Untuk TBADH and
SAADH, yield-nya sangat rendah, yaitu sekitar 5-10%. Bahkan, pada
SAADH untuk DBF, tidak ada produk yang dihasilkan.

Bioreduksi PTX, PPT and DBF dengan berbagai ADH.

Modifikasi
Reaksi alkohol dehidrogenase dari hati kuda dengan imidoester atau
sianat pada pH 8 meningkatkan aktivitas enzim. Metil pikolinimidat
meningkatkan aktivitas enzim hingga 19 kali lipat, dan memodifikasi
skeitar 50 dari 60 gugus amino. Inhibisi produk menunjukkan bahwa
reaksi yang dikatalisis oleh enzim native dan yang sudah dimodifikasi
memiliki mekanisme yang sama, bi bi berurutan. Enzim yang sudah
dimodifikasi memiliki 1% dari 53 kali lipat tetapan Michaelis-Menten yang
lebih besar, dan turnover number yang 12-30 kali lipat lebih besar. Tahap
penentu laju pada reaksi yang maju atau kebalikannya adalah penguraian
kompleks enzim-koenzim. Enzim yang sudah dimodifikasi mungkin
memberikan laju yang lebih besar karena kompleksnya dapat berdisosiasi
lebih cepat.

Daftar Pustaka
Edenberg, H. J. (2007). Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde
Dehydrogenase Variants. Alcohol Research & Health , 5-13.
Machielsen, R. (2006). Production and Characterization of a Thermostable
Alcohol Dehydrogenase That Belongs to the Aldo-Keto Reductase
Superfamily. Applied and Environmental Microbiology , 233-238.
Nie, Y., Xu, Y., Mu, X. Q., Wang, H. Y., Yang, M., & Xiao, R. (2007).
Purification, Charecterization, Gene Cloning, and Expression of a Novel
Alcohol Dehydrogenase with Anti-Prelog Stereospecificity from Candida
parapsilosis. Applied and Environmental Microbiology , 3759-3764.
Zanon, J. P. (2006). Colorimetric Assay of Ethanol Using ALcohol
Dehydrogenase from Dry Baker's Yeast. Enzyme and Microbial
Technology .

Bryce V. Pupp. Enhancement of the Activity of Horse Liver Alcohol

Dehydrogenase by Modification of Amino Groups at the Active Sites.
Journal of Biological Chemistry Vol. 245 no. 7. (1969)
Z. Liu, et al. Enzymes from Higher Eukaryotes for Industrial Biocatalysis,
Food Technol. Biotechnol. 42 (4) 237249 (2004).
Katja Goldberg, Kirsten Schroer , Stephan Ltz, dan Andreas Liese.
Biocatalytic Ketone Reduction A Powerful Tool for The Production
of Chiral Alcohols Part I:
Processes With Isolated Enzymes. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76 :
237248.
Elbieta Pkala dan Dorota elaszczyk. Alcohol Dehydrogenases as
Tools for the Preparation of Enantiopure Metabolites of Drugs with
Methyl Alkyl Ketone Moiety. Sci Pharm. 2009; 77: 917.