Anda di halaman 1dari 10

IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA SAMPEL DENGAN

MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS

Ni Kadek Dwi Widyastuti


Program Studi Pendidikan Kimia, Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas MIPA, UNDIKSHA
Jalan Udayana, Singaraja-Bali
Email: dwiwidyastuti2008@gmail.com

ABSTRAK

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari berbagai asam
amino dan menentukan kandungan asam amino pada sampel melalui kromatografi kertas dengan teknik
ascending. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah metode kuantitatif dengan cara kromatografi
kertas. Hasil yang diperoleh dari percobaan ini yaitu nilai Rf dari asam amino triptofan, leusin, tirosin,
metionin dan glisin dalam eluen fenol berturut-turut adalah 0,554, 0,92, 0,14, 0,89, dan 0,78, sedangkan
perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari asam amino triptofan, leusin, tirosin, metionin dan glisin dalam
eluen campuran n-butanol, akuades dan asam aetat glasial berturut-turut: 0,59, 0,7, 0,21, 0,42 dan 0,2.
Diidentifikasi berdasarkan perbandingan nilai Rf sampel dengan standar dan karakteristik larutan sampel dan
standar diprediksi bahwa sampel sampel unknown A mengandung asam amino leusin, triptofan, glisin dan
metionin, sampel unknown B mengandung asam amino metionin dan glisin, dan sampel unknown C
mengandung asam amino glisin dan triptofan.

Kata kunci : kromatografi kertas, asam amino, nilai Rf, identifikasi

ABSTRACT

This experiment purpose to compare the distribution coefficient (Rf) of various amino acids and
determine the amino acid content in the sample through the ascending paper chromatography techniques. The
method used in this experiment is a quantitative method by means of paper chromatography. The results
obtained from this experiment that the Rf value of the amino acid tryptophan, leucine, tyrosine, methionine, and
glycine in the eluent successive phenol was 0.554, 0.92, 0.14, 0.89, and 0.78, while the ratio of the coefficient
distribution (Rf) of the amino acid tryptophan, leucine, tyrosine, methionine, and glycine in the eluent a mixture
of n-butanol, distilled water and glacial aetat acid, respectively: 0.59, 0.7, 0.21, 0.42 and 0, 2. Rf values were
identified by comparison with standard samples and the characteristics of the sample solution and the standard
predicted that the unknown sample A sample containing amino acids leucine, tryptophan, glycine and
methionine, unknown sample B contains the amino acid methionine and glycine, and unknown sample C
contains amino acids glycine and tryptophan.

Keywords: paper chromatography, amino acids, the value of Rf, identification

PENDAHULUAN
Manusia dalam hidupnya selalu Asam amino memiliki peranan yang
membutuhkan nutrisi untuk dapat tumbuh dan penting bagi kehidupan manusia. Mulai dari
berkembang. Nutrisi dapat diperoleh dari memastikan bahwa pembelahan sel terjadi
berbagai bahan makanan. Pada umumnya dengan sempurna, fungsi-fungsi metabolisme,
bahan makanan mengandung tiga kelompok memelihara daya ingat, pertumbuhan,
utama senyawa kimia, yaitu karbohidrat, penyembuhan hingga sebagai bangunan blok
protein, dan lemak. Protein merupakan suatu protein yang linear dari rantai asam amino.
senyawa yang terdapat dalam semua jaringan Banyaknya manfaat dari asam amino dalam
hidup baik tumbuhan maupun hewan. Fungsi tubuh, sehingga diperlukan suatu analisis
biologis protein sangat beragam, antara lain untuk mengidentifikasi keberadaan asam
sebagai pembangun, pengatur, pertahanan, dan amino yang terkandung dalam suatu sampel.
sebagai sumber energi. Protein tergolong Salah satu cara untuk mengidentifikasi asam
senyawa makromolekul polimer yang amino adalah teknik kromatografi kertas.
terbentuk melalui reaksi kondensasi asam-
asam amino sebagai monomernya (Frieda, Teknik pemisahan kromatografi ini
dkk. 2002). pertama kali diperkenalkan oleh Michael
Tswet (1906) seorang ahli botani dari Rusia.
“chroma” dan “graphein”. Dalam
Kromatografi berasal dari kata

bahasa Yunani kedua kata tersebut


berarti “warna” dan “menulis”. Pengertian
kromatografi
jenis kromatografi yang memiliki fase diam
menyangkut metode pemisahan yang dan fase gerak berupa cairan yang tidak saling
didasarkan atas distribusi diferensial bercampur. Fase diam dalam kromatografi
komponen sampel diantara dua fase, yaitu fase berupa air yang terikat selulosa kertas
diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile sedangkan fasa geraknya berupa pelarut
phase). Fase gerak akan membawa komponen organik non polar. Berdasarkan kedua hal itu
yang dapat mengakibatkan pergerakan kromatografi kertas dapat digolongkan ke
diferensial dari komponen. Fase diam dapat dalam kromatografi partisi. Dalam
berupa padatan atau cairan yang terikat pada kromatografi kertas fasa gerak akan merembes
permukaan padatan (kertas atau suatu ke dalam kertas karena efek kapiler. Rembesan
adsorben), sedangkan fase gerak dapat berupa fasa gerak pada kertas dapat dilakukan dengan
cairan yang disebut dengan eluen atau pelarut, teknik menaik (ascending) atau dengan teknik
atau gas pembawa yang inert. Gerakan fase menurun (descending). Pada teknik ascending
gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi rembesan fasa gerak bergerak ke atas
diferensial komponen-komponen dalam sedangkan pada teknik descending rembesan
sampel (Tika,2010). fasa gerak bergerak ke bawah. Pada teknik
menurun rembesan fasa gerak disamping
Keuntungan pemisahan dengan bergerak karena efek kapiler juga dibantu oleh
metode kromatografi dibandingkan dengan efek gravitasi sehingga rembesan berjalan
metode pemisahan lainnya adalah lebih cepat. (Soebagio, dkk., 2000)
kromatografi dapat digunakan untuk sampel
atau konstituen yang sangat kecil (semi mikro Kromatografi kertas ini sangat
dan makro), cukup selektif terutama untuk berguna untuk pemisahan zat anorganik,
senyawa senyawa organik multi komponen, organik, dan biokimia dalam jumlah yang
proses pemisahan dapat dilakukan dengan sedikit. Dalam percobaan ini dilakukan
waktu yang relatif singkat, harganya murah analisis secara kualitatif terhadap larutan yang
dan sederhana, karena umumnya tidak mengandung bermacam-macam asam amino.
memerlukan alat yang mahal dan rumit Kromatografi kertas dapat dilakukan secara
(Soebagio, dkk., 2000). satu dimensi atau dua dimensi. Apabila macam
komponen tidak terlalu banyak, maka cara dua
Dalam kromatografi selalu terjadi dimensi seringkali diperlukan. Untuk itu
kecenderungan sebagai berikut: (a) diperlukan dua macam larutan eluen, yang satu
kecenderungan molekul-molekul komponen diperlukan untuk ke satu arah, dan yang kedua
untuk melarut dalam cairan, (b) diperlukan untuk ke arah lain yang tegak lurus
kecenderungan molekul-molekul komponen pada arah elusi, setelah kromatografi kering.
untuk melekat pada permukaan padatan halus (Tika 2010)
(adsorpsi = penyerapan), (c) kecenderungan
molekul-molekul komponen untuk bereaksi Kromatografi kertas sangat berguna
secara kimia (penukar ion), dan (d) dalam biokimia, mengingat dalam praktikum
kecenderungan molekul-molekul tereklusi biokimia sering kali dijumpai sampel-sampel
pada pori-pori fase diam (Tika, 2010). kecil dan kompleks. Campuran asam-asam
amino sederhana dapat dipisahkan dengan
Teknik kromatografi ada berbagai eluen fenol jenuh sebagai pengembang.
macam, salah satunya adalah kromatografi Sebagai fase diam, pada umumnya air yang
kertas. Kromatogarfi kertas merupakan bentuk terserap pada pori-pori kertas. Oleh karena itu,
kromatografi yang paling sederhana, mudah fase diamnya bersifat sedikit polar. Apabila
dan murah. Jenis kromatografi ini merupakan diinginkan fase diam yang baik, maka
bidang khusus kromatografi cair-cair. biasanya kertas kromatogram dikeringkan,
Kromatografi kertas merupakan salah satu
kemudian menggunakan fase diam seperti Setiap komponen memiliki harga Rf
glikol, formanida, dan juga alkohol. tertentu. Jarak yang ditempuh oleh setiap
senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak
Pelaksanaan pemisahan dengan tempuh pelarut/eluen didefinisikan sebagai Rf.
metode kromatografi kertas terbagi dalam tiga
tahap yaitu tahap penotolan cuplikan, tahap Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
pengembangan, dan tahap identifikasi. Pada Rf 
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar
tahap penotolan kertas kromatografi yang
sudah disiapkan ditotolak larutan cuplikan
dengan menggunakan mikropipet atau pipa
kapiler pada garis yang sudah dibuat. Pada Nilai Rf dari suatu senyawa pada sistem
tahap pengembangan, ujung kertas kromatografi kertas bergantung pada banyak
kromatografi yang dekat garis awal yang telah variabel, di antaranya sistem pelarut,
berisi totolan cuplikan dicelupkan ke dalam temperatur, lamanya elusi, dan jenis kertas.
pelarut (eluen) yang terdapat dalam bejana Karena dipengaruhi oleh banyaknya variabel,
kromatografi. Komponen-komponen cuplikan maka Rf suatu senyawa yang sudah diketahui
akan terbawa oleh rembesan cuplikan. dijadikan standar atau patokan untuk
Perbedaan kelarutan komponen-komponen menentukan Rf senyawa lainnya.
cuplikan dalam eluen akan mengakibatkan
kecepatan bergerak komponen-komponen Dalam praktikum ini dilakukan
dalam kertas juga berbeda. Perbedaan analisis secara kualitatif terhadap larutan yang
kecepatan bergerak komponen-komponen ini mengandung bermacam-macam asam amino.
lenih umum disebut migrasi diferensial. Hasil Pengamatan yang dilakukan cukup sulit
pemisahan akan nampak sebagai noda-noda mengingat asam amino yang terlarut tidak
berwarna pada kertas dengan jarak yang menunjukkan warna tertentu. Untuk
berbeda-beda dari awal. Pada tahap mengantisipasi hal tersebut, maka setelah elusi
identifikasi atau penampakan noda, jika noda dihentikan, posisi eluen ditandai dengan
sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan pensil, lalu kromatogram dikeringkan dan
ditentukan Rf-nya. Besaran Rf ( rate of flow) selanjutnya disemprot dengan larutan
menyatakan derajat retensi suatu komponen ninhidrin. Ninhidrin akan bereaksi dengan
dalam fasa diam. Keran itu, Rf juga disebut asam amino menghasilkan senyawa berwarna,
faktor referensi atau faktor refensi ( Soebagio, umumnya berwarna cokelat dan ungu, dengan
2000). reaksi sebagai berikut.

O O
H
OH O OH

H2N C C NH3(aq) CO2 RCHO


(g) (aq)
OH H
(aq) OH (aq) (aq)
R
O O

O O
O O
OH H H H

N N 3H2O(l)
OH (aq) H2 O (aq) (aq)
H (aq)
O O
O O

Gambar 1. Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino

METODE kromatografi, 1 buah gelas kimia 250 mL, 1


buah gelas kimia 100 mL, 2 buah batang
Alat dan Bahan pengaduk, 1 buah spatula, 1 buah penggaris, 1
Alat yang digunakan dalam percobaan buah gunting, 1 buah pinset, 1 buah pemanas
ini adalah 4 buah pipa kapiler, 1 buah ruang listrik, 2 buah pipet tetes, 1 buah corong pisah
250 mL serta 1 set statif dan klem. Bahan yang
digunakan dalam percobaan ini adalah 100 mL Proses Kromatografi Dengan Menggunakan
larutan n-butanol, 24 mL asam asetat glasial, 2 Eluen Campuran N-Butanol, Aquades dan
mL larutan glisin, 2 mL larutan triptofan, 2 mL Asam Asetat Glasial
larutan leusin, 2 mL larutan tirosin, 2 mL Siapkan kertas kromatografi dengan
larutan metionin, masing-masing 2 mL larutan ukuran 15 x 25 cm dan ditandai dengan pensil
unknown A, B dan C, 200 mL aquades dan 1,5 cm dari tepi bawah. Kemudian, dengan
100 mL fenol 2,5% . pipa kapiler ditotolkan larutan standar asam
amino dan sampel berdampingan dengan jarak
1,5 cm. Larutan ujung terletak 2 cm dari
Prosedur Kerja pinggir kertas. Setelah itu, tiap-tiap tetesan
harus dikeringkan dulu, misalnya dengan alat
Pembuatan Larutan Eluen Campuran n- pengering rambut. Haruslah diusahakan
Butanol supaya cukup asam amino ditempatkan pada
Sebanyak 100 mL larutan n-butanol kertas tersebut. Sedangkan besar noda
ditambahkan 100 mL aquades dan 24 mL hendaknya jangan melebihi diameter 0,4 cm.
asam asetat glasial. Ketiga larutan tersebut hendaknya kertas juga bersih dan sedapat
ditempatkan ke dalam corong pisah dan mungkin jangan disentuh oleh jari, gunakan
dikocok. Kedua lapisan yang terbentuk pinset. Karena diyakinkan ruang kromatografi
kemudian dipisahkan. telah jenuh oleh uap eluen. Kemudian kertas
tersebut digantungkan dalam ruang
Penyiapan Kertas Kromatografi kromatografi dan dicelupkan tepi bawah kertas
Kertas kromatografi disiapkan dengan kromatografi dalam eluen, usahakan jangan
ukuran yang disesuaikan dengan wadah sampai totolan asam amino standar dan sampel
kromatografi. Pada bagian sekitar 1,5 cm dari terendam oleh eluen. Elusi asam amino standar
tepi bawah kertas ditandai dengan pensil. dan sampel kira-kira eluen menempuh jarak 10
cm. Elusi dihentikan dan ditandai jarak yang
Proses Kromatografi dengan Menggunakan ditempuh oleh eluen dengan pensil. Kertas
Eluen Fenol kromatografi selanjutnya dikeringkan pada
Kertas kromatografi dengan ukuran 15 suhu 105-110oC. Kemudian kertas disemprot
x 25 cm ditotolkan dengan larutan I, II, III, IV, dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan
V, A, B dan C (larutan triptofan, leusin, kembali pada suhu 105-110oC selama 5 menit.
tirosin, metionin, glisin, larutan sampel A, Noda-noda asam amino yang akan terlihat.
larutan sampel B dan larutan sampel C) Selanjutnya dapat dihitung harga Rf-nya.
menggunakan pipet kapiler. Jarak totolan
antara satu dengan yang lain adalah 1,5 cm. HASIL DAN PEMBAHASAN
Perlu diperhatikan tiap tetesan harus Praktikum dengan menggunakan
dikeringkan terlebih dahulu dengan diangin- teknik kromatografi kertas didasarkan atas
anginkan sebelum tetesan berikutnya distribusi diferensial komponen sampel
ditotolkan. Besar noda hendaknya jangan diantara dua fasa. Kromatografi kertas
melebihi 0,4 cm. Kertas dijaga bersih dan melibatkan dua fasa yang terdiri dari fasa diam
sedapatnya tidak tersentuh jari. Selanjutnya, (stationary phase) dan fase gerak (mobil
kertas digantungkan dalam ruang kromatografi phase). Fasa diam dalam kromatografi kertas
selama beberapa jam agar elusi dapat berjalan. berupa air sedangkan fasa geraknya berupa
Setelah larutan elusi berjalan kurang lebih 10 pelarut organik non polar. Praktikum
cm dari batas sampel, elusi dihentikan dan kromatografi kertas ini dilakukan untuk
kertas kromatografi dikeluarkan dari ruang menentukan asam amino yang terdapat pada
kromatografi. Kemudian, batas larutan campuran asam amino dengan
ditandai dengan pensil dan kertas kromatografi membandingkan harga Rf masing-masing
dikeringkan pada suhu 100-105oC. Setelah itu, asam amino yang terdeteksi pada sampel
kertas yang telah dikeringkan disemprot dengan standar. Teknik kromatografi kertas
dengan larutan ninhidrin yang selanjutnya yang digunakan adalah teknik rembesan
dikeringkan kembali dalam oven. Kemudian, menaik (ascending). Pada teknik ascending,
diukur jarak eluen dengan jarak warna yang campuran pelarut (eluen) akan bermigrasi
dibentuk. melewati noda (spot) dengan arah ke atas.
Pada percobaan ini digunakan dua eluen yaitu dalam corong pisah dan dikocok terbentuk
eluen fenol dan eluen campuran n-butanol, campuran yang berwarna keruh. Setelah
asam asetat glasial dan aquades. didiamkan terbentuk dua lapisan. Lapisan atas
berupa cairan yang berwarna keruh, sedangkan
Campuran eluen n-butanol, asam lapisan bawah berupa cairan bening tak
asetat glasial, dan akuades dibuat dengan berwarna (gambar 2).
mencampurkan ketiga larutan tersebut ke

Gambar 2. Campuran n-butanol, asam asetat glasial dan akuades


membentuk dua lapisan

Terbentuknya dua lapisan ini disebabkan kromatografi kertas. Molekul air sebagai fasa
karena ketiga larutan tidak bercampur secara diam yang teradsorpsi pada permukaan kertas
sempurna. Hal ini disebabkan karena air dan menghasilkan ribuan tetes kecil sehingga
asam asetat dapat bercampur secara sempurna memungkinkan air bertindak sebagai fasa
dikarenakan ke dua senyawa tersebut adalah diam. Fasa diam yang teradsorpsi akan
kovalen polar. Demikian juga, dengan n- dilewati oleh fasa gerak yaitu komponen non
butanol dan asam asetat dapat bercampur polar dari eluen (n-butanol) atau fenol (non
sempurna ke dua-duanya sama-sama polar). Hal ini mengakibakan terjadi partisi
merupakan senyawa organik. Sedangkan air atau pemisahan campuran karena adanya
dan n-butanol hanya bercampur sebagian perbedaan distribusi asam amino yang
sehingga ketika campuran tersebut didiamkan menyusun campuran asam amino dalam fasa
setelah dikocok, terlihat adanya dua lapisan. gerak dan air sebagai fasa diam.

Asam asetat ditambahkan dalam Praktikum dengan menggunakan


pembuatan eluen ini bertujuan untuk kertas kromatografi harus benar-benar terjaga
mendistribusikan kedua pelarut yang tidak kebersihan kertasnya. Kertas kromatografi
saling bercampur. Larutan n-butanol dan air yang digunakan dihindarkan dari kontak
sama-sama dapat terdistribusi dalam asam langsung dengan tangan, sedapat mungkin
asetat sehingga dengan ditambahkannya asam tidak tersentuh oleh tangan, tetapi dipegang
asetat glasial pada perbandingan volume dengan menggunakan penjepit atau
tertentu dapat diperoleh campuran atau cairan melengkapi tangan dengan menggunakan slop
yang mengandung n-butanol-asam asetat dan tangan. Apabila terjadi kontak antara tangan
air. Pengocokan dilakukan dengan tujuan dengan kertas kromatografi maka
untuk lebih menyempurnakan distribusi antara kemungkinan dapat mengganggu proses
ketiga cairan tersebut. Dalam hal ini, n-butanol kromatografi. Tangan seringkali dalam
sebagai pelarut nonpolar bertindak sebagai keadaan lembab karena mengeluarkan keringat
fase gerak, dan air (pelarut polar) bertindak sebagai hasil pengeluaran dari tubuh manusia.
sebagai fase diam. Keringat ini mengandung minyak dan urea
yang merupakan zat organic sehingga
Air sebagai fasa diam umumnya kemungkinan senyawa-senyawa organik
terserap pada pori-pori kertas. Oleh karena itu tersebut akan ikut bermigrasi sebagai fase
fasa diam bersifat polar. Molekul air sebagai nonpolar (fase gerak). Hal inilah yang
fasa diam yang polar akan terdistribusi pada nantinya akan dapat mempengaruhi proses dan
permukaan kertas, interaksi ini merupakan hasil dari kromatografi.
efek yang sangat penting selama proses
Wadah kromatografi yang akan kemungkinan akan terjadi perembesan dari
digunakan terlebih dahulu harus dijenuhkan fase gerak dan fase diamnya sehingga menjadi
dengan eluen. Pada tahap pertama, wadah tidak jelas karena warna yang terdeteksi terlalu
kromatografi dijenuhkan dengan eluen fenol. menyebar dan menggangu hasil pengamatan
Proses penjenuhan dilakukan dengan sehingga sulit untuk menghitung harga Rf-nya.
memasukkan eluen fenol ke dalam wadah Kertas kromatografi yang digunakan pada
kromatografi dan ditutup. Penjenuhan percobaan ini berjumlah dua lembar. Tujuan
bertujuan untuk mempersiapkan kondisi agar digunakan kertas kromatografi dua lembar
kromatografi dapat berjalan lebih cepat. Hal agar jarak totolan antar larutan yang akan diuji
ini dikarenakan ketika udara dalam lebih jauh sehingga akan lebih mudah dalam
kromatografi sudah jenuh begitu pula dengan mengamati rembesan noda-noda dari larutan
kertasnya maka ketika elusi sampel dimulai, yang diuji. Kertas kromatografi pertama berisi
eluen tersebut akan fokus bekerja untuk larutan asam amino yang terdiri dari larutan
mengelusi komponen sampel. triptofan, leusin, tirosin, dan glisin, sedangkan
untuk kertas kromatografi kedua berisi larutan
Tahap pertama adalah penotolan asam glisin, sampel A, sampel B, dan sampel C.
amino dan sampel pada kertas kromatografi Setiap menotolkan larutan yang akan diuji,
yang menggunakan pipa kapiler. Penggunaan totolan tersebut dikeringkan dengan cara
pipa kapiler dalam penotolan bertujuan agar diangin-anginkan terlebih dahulu kemudian
asam amino dan sampel pada kertas dilanjutkan dengan menotolkan kembali
diameternya tidak melebihi 0,4 cm. Apabila larutan asam amino lain yang akan diuji
diameter totolan melebihi 0,4 cm, (gambar 3).

Gambar 3. Totolan Dikeringkan dengan Cara Diangin-Anginkan

Tahap selanjutnya adalah tahap merendam totolan asam amino dan sampel
pengembangan. Pada tahap pengembangan, atau garis awal. Setelah kertas kromatografi
kertas kromatografi yang sudah berisi larutan dicelupkan, eluen langsung merembes
yang akan diuji dimasukkan ke dalam wadah melewati totolan larutan yang diuji (gambar
kromatografi yang sudah dijenuhkan dengan 4).
eluen fenol. Pencelupan diusahakan tidak

Gambar 4. Kertas Kromatografi Dimasukkan ke dalam


Cember Kromatografi

Komponen-komponen larutan yang diuji akan kecepatan bergerak komponen-komponen


terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan dalam kertas juga berbeda. Perembesan
kelarutan komponen-komponen larutan yang dihentikan setelah eluen hampir bergerak
diuji dalam eluen akan mengakibatkan sekitar ±10 cm. Setelah eluen bergerak
bergerak sekitar ±10 cm, kertas kromatografi pengamatan karena ninhidrin akan
dikeluarkan dari wadah kromatografi. memberikan warna apabila bereaksi dengan
asam amino. Namun, warna tidak langsung
Pada tahap identifiksi atau muncul ketika disemprotkan ninhidrin karena
penampakann noda, jarak tempuh eluen yang diduga masih terdapat molekul-molekul air
ditempuh ditandai dengan pensil dan kertas yang teradsorpsi sehingga ninhidrin tidak
dikeringkan pada suhu 100-105oC. Hal ini dapat bereaksi sempurna dengan asam amino
dikarenakan pada suhu ini molekul air akan yang terdistribusi pada fase polar (air) dan fase
menguap. Setelah dikeringkan belum ada gerak (n-butanol). Untuk mengatasi hal
penampakan noda sehingga untuk tersebut, kertas dikeringkan kembali di atas
menampakan noda tersebut dilakukan pemanas listrik. Setelah kering, timbul warna
penyemprotan kertas dengan larutan ninhidrin. berupa bercak-bercak ungu yang
Tujuan disemprotkan larutan ninhidrin pada mengindikasikan adanya asam amino (gambar
kertas kromatografi untuk memudahkan 5).

(a) (b)
Gambar 5. (a)Warna noda ungu pada kromatografi larutan I, II, III, dan IV dengan eluen
fenol, (b) warna noda ungu pada kromatografi larutan V, A, B dan C dengan eluen
fenol

Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dengan asam amino adalah sebagai berikut.
O O
H
OH O OH
H2N C C NH3(aq) CO2 RCHO
(g) (aq)
OH H
(aq) OH (aq) (aq)
R
O O

O O
O O
OH H H H

N N 3H2O(l)
OH (aq) H2 O (aq) (aq)
H (aq)
O O
O O

Gambar 6. Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino

Setelah timbul warna maka Rf dapat dihitung senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak
sebagai jarak yang ditempuh asam amino tempuh pelarut/eluen, dengan rumus sebagai
berbanding dengan jarak yang ditempuh eluen. berikut.
Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh setiap
Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
Rf 
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar
Untuk mengidentifikasi jenis asam unknown A, B, dan C dapat dilakukan dengan
amino apa saja yang terdapat pada sampel membandingkan nilai Rf larutan sampel A, B,
dan C dengan Rf standar yaitu dari larutan kertas dengan menggunakan eluen fenol serta
asam amino triptofan, leusin, tirosin metionin nilai Rf nya adalah sebagai berikut.
dan glisin. Data hasil praktikum kromatografi
Tabel 1. Data hasil kromatografi dengan eluen fenol

Asam Amino Jarak Tempuh Eluen Jarak Tempuh Komponen Rf


(cm) (cm)
Triptofan 12,8 7,1 0,55
Leusin 12,8 11,9 0,93
Tirosin 12,8 1,8 0,14
Metionin 12,8 11,5 0,89
Glisin 14,5 11,3 0,78
Sampel Unknown A 14,5 13,3 0,92
14,5 12,2 0,84
14,5 7,6 0,52
Sampel Unknown B 14,5 13,0 0,89
Sampel Unknown C 14,5 10,8 0,75

Dalam menentukan asam amino yang leusin, metionin dan triptofan. Selanjutnya
ada pada sampel unknown digunakan selisih nilai Rf dari sampel B mendekati nilai Rf dari
Rf paling kecil yang merupakan asam amino asam amino metionin sehingga sampel B
yang dimaksud. Berdasarkan data di atas, diduga mengandung asam amino metionin.
dapat diketahui bahwa sampel A pada eluen Sampel C memiliki nilai Rf mendekati nilai Rf
fenol memiliki nilai Rf yang mendekati leusin, dari asam amino glisin sehingga sampel C
metionin, dan triptofan. Bila dilihat dari selisih diduga mengandung asam amino glisin.
antara Rf sampel A dengan Rf dari larutan Adapun data selisih Rf Sampel Unknown
leusin, metionin, dan triptofan memiliki nilai dengan Rf Standar pada Eleuen fenol sebagai
yang lebih kecil (paling mendekati) sehingga berikut.
sampel A diduga mengandung asam amino
Tabel 2.Data Selisih Rf Sampel Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen fenol

Sampel Selisih Rf sampel dengan Rf asam Hasil


amino standar
Sampel Unknown A 0,93 - 0,92 0,01 (Leusin)
0,89 - 0,84 0,05 (Metionin)
0,55 - 0,52 0,03 (Triptofan)
Sampel Unknown B 0,89 - 0,89 0,00 (Metionin)
Sampel Unknown C 0,78 - 0,75 0,04 (Glisin)

Percobaan yang kedua dilakukan kertas kromatografi pada percobaan


kromatografi kertas dengan menggunakan menggunakan eluen fenol yaitu mengeringkan
eluen campuran n-butanol, akuades, dan asam di atas pemanas listrik dan setelah kering
asetat glasial. Pada eluen n-butanol wadah disemprot dengan larutan ninhidrin. Kemudian
kromatografi juga dilakukan penjenuhan, dikeringkan kembali di atas pemanas listrik.
dengan memasukkan eluen n-butanol serta Setelah dikeringkan timbul warna ungu
campurannya. Kromatografi menggunakan (gambar 7), kemudian diukur jarak tempuh
eluen n-butanol tekniknya sama dengan eluen dan jarak sampel masing-masing asam
kromatografi menggunakan eluenn fenol. amino serta sampel A,B, dan C yang terdapat
Setelah proses kromatografi selesai, kertas pada kertas kromatografi.
kromatografi juga diperlakukan sama seperti
(a) (b)
Gambar 7. (a) Warna noda ungu pada kromatografi larutan I, II, III dan IV dengan eluen campuran
n-
butanol, dan (b) warna noda ungu pada kromatografi larutan V, A, B dan C dengan eluen
campuran n-butanol

Jarak tempuh eluen dan larutan sampel setelah dilakukan pengukuran pada masing-masing
kertas didapatkan data sebagai berikut.

Tabel 3. Data hasil kromatografi dengan eluen n-butanol

Asam Amino Jarak Tempuh Eluen Jarak Tempuh Komponen Rf


(cm) (cm)
Triptofan 10 5,9 0,59
Leusin 10 7,0 0,70
Tirosin 10 2,1 0,21
Metionin 10 4,2 0,42
Glisin 10 2,0 0,20
Sampel Unknown A 10 5,0 0,50
10 3,0 0,30
10 1,6 0,16
Sampel Unknown B 10 4,8 0,48
10 1,2 0,12
Sampel Unknown C 10 5,8 0,58
10 2,5 0,25

Untuk mengetahui kandungan asam nilai yang lebih kecil (paling mendekati)
amino pada sampel dilakukan perhitungan sehingga sampel A diduga mengandung asam
selisih nilai Rf sampel dengan nilai Rf larutan amino triptofan, metionin dan glisin.
asam amino standar pada eluen campuran n- Selanjutnya nilai Rf dari sampel B mendekati
butanol, asam asetat glasial, dan aquades . nilai Rf dari asam amino metionin dan glisin
Dalam menentukan asam amino yang ada pada sehingga sampel B diduga mengandung asam
sampel unknown digunakan selisih Rf paling amino metionin dan glisin. Kemudian nilai Rf
kecil yang merupakan asam amino yang dari sampel C sama dengan nilai Rf dari asam
dimaksud. Berdasarkan data di atas,dapat amino triptopan dan glisin sehingga sampel C
diketahui bahwa sampel A pada eluen diduga mengandung asam amino triptopan dan
campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan glisin. Adapun data selisih Rf Sampel
aquades memiliki nilai Rf yang mendekati Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen
triptofan, metionin, dan glisin. Bila dilihat campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan
dari selisih antara Rf sampel A dengan Rf dari aquades sebagai berikut.
larutan triptofan, metionin, dan glisin memiliki
Tabel 4. Data Selisih Rf Sampel Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen n-butanol

Sampel Selisih Rf nilai Rf sampel dengan Hasil


asam amino standar
Sampel Unknown A 0,59 - 0,50 0,09 (Triptofan)
0,42 - 0,30 0,12 (Metionin)
0,20 - 0,16 0,04 (Glisin)
Sampel Unknown B 0,48 - 0,42 0,06 (Metionin)
0,20 - 0,12 0,08 (Glisin)
Sampel Unknown C 0,59 – 0,58 0,01 (Triptofan)
0,25 – 0,20 0,05 (Glisin)

Berdasarkan data yang didapatkan 2. Sampel unknown A mengandung asam


pada kedua eluen yang berbeda, diperoleh amino leusin, triptofan, glisin dan
bahwa sampel unknown A mengandung asam metionin, sampel unknown B mengandung
amino leusin, triptofan, metionin, dan glisin. asam amino metionin dan glisin, dan
Sampel B mengandung asam amino metionin sampel unknown C mengandung asam
dan glisin, sedangkan pada sampel C amino glisin dan triptofan.
mengandung asam amino triptofan dan glisin.
Namun, terdapat perbedaan kandungan yang UCAPAN TERIMA KASIH
ada dalam sampel unknown pada saat
menggunakan eluen fenol dan eluen campuran Ucapan terima kasih penulis sampaikan
n-butanol, asam asetat glasial, serta akuades kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
disebabkan karena eluen yang belum dosen pengampu mata kuliah Praktikum
terdistribusi secara maksimal sehingga Biokimia atas bimbingan dan masukan selama
pemisahan belum terjadi secara sempurna. praktikum ini, Kadek Dewi Wirmandianthy,
Terjadi sentuhan atau gesekan antar S.Pd, M.Si selaku asisten dosen, dan I Dewa
kromatogram ketika proses elusi, sehingga Subamia selaku laboran di Jurusan Pendidikan
berdampak pada kesulitan dalam Kimia atas bantuan dalam memberikan segala
mengidentifikasi zat yang terkandung dalam keperluan yang berkaitan dengan praktikum
sampel. Selain itu juga karena ketidaktepatan sehingga percobaan ini dapat dilaksanakan
saat menotolkan larutan pada kertas dengan baik.
kromatografi yang seharusnya pentotolan DAFTAR PUSTAKA
larutan tidak melebihi diameter 0,4 cm.
Dengan demikian pada eluen fenol distribusi Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II.
noda asam amino yang terkandung pada Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu
sampel unknown sulit untuk diidentifikasi. Hal Pendidikan Negeri Singaraja.
inilah menjadi penyebab perbedaan asam Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum
amino yang didapatkan pada sampel unknown Biokimia. Singaraja : Universitas
antara menggunakan elun fenol dan eluen n- Pendidikan Ganesha
butanol.
Soebagio,dkk. 2000. Kimia Analitik II.
SIMPULAN Malang: Universitas Negeri Malang.

Berdasarkan pembahasan di atas dapat ditarik Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum
simpulan sebagai berikut: Biokimia. Singaraja: Universitas
1. Perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari Pendidikan Ganesha
asam amino triptofan, leusin, tirosin,
metionin dan glisin dalam eluen fenol
berturut-turut: 0,554, 0,92, 0,14, 0,89, dan
0,78. Perbandingan koefisien distribusi
(Rf) dari asam amino triptofan, leusin,
tirosin, metionin dan glisin dalam eluen n-
butanol berturut-turut: 0,59, 0,7, 0,21,
0,42 dan 0,2.