IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA SAMPEL DENGAN

MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS

Ni Kadek Dwi Widyastuti

Program Studi Pendidikan Kimia, Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas MIPA, UNDIKSHA
Jalan Udayana, Singaraja-Bali
Email: dwiwidyastuti2008@gmail.com

ABSTRAK

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari berbagai asam
amino dan menentukan kandungan asam amino pada sampel melalui kromatografi kertas dengan teknik
ascending. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah metode kuantitatif dengan cara kromatografi
kertas. Hasil yang diperoleh dari percobaan ini yaitu nilai Rf dari asam amino triptofan, leusin, tirosin,
metionin dan glisin dalam eluen fenol berturut-turut adalah 0,554, 0,92, 0,14, 0,89, dan 0,78, sedangkan
perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari asam amino triptofan, leusin, tirosin, metionin dan glisin dalam
eluen campuran n-butanol, akuades dan asam aetat glasial berturut-turut: 0,59, 0,7, 0,21, 0,42 dan 0,2.
Diidentifikasi berdasarkan perbandingan nilai Rf sampel dengan standar dan karakteristik larutan sampel dan
standar diprediksi bahwa sampel sampel unknown A mengandung asam amino leusin, triptofan, glisin dan
metionin, sampel unknown B mengandung asam amino metionin dan glisin, dan sampel unknown C
mengandung asam amino glisin dan triptofan.

Kata kunci : kromatografi kertas, asam amino, nilai Rf, identifikasi

ABSTRACT

This experiment purpose to compare the distribution coefficient (Rf) of various amino acids and
determine the amino acid content in the sample through the ascending paper chromatography techniques. The
method used in this experiment is a quantitative method by means of paper chromatography. The results
obtained from this experiment that the Rf value of the amino acid tryptophan, leucine, tyrosine, methionine, and
glycine in the eluent successive phenol was 0.554, 0.92, 0.14, 0.89, and 0.78, while the ratio of the coefficient
distribution (Rf) of the amino acid tryptophan, leucine, tyrosine, methionine, and glycine in the eluent a mixture
of n-butanol, distilled water and glacial aetat acid, respectively: 0.59, 0.7, 0.21, 0.42 and 0, 2. Rf values were
identified by comparison with standard samples and the characteristics of the sample solution and the standard
predicted that the unknown sample A sample containing amino acids leucine, tryptophan, glycine and
methionine, unknown sample B contains the amino acid methionine and glycine, and unknown sample C
contains amino acids glycine and tryptophan.

Keywords: paper chromatography, amino acids, the value of Rf, identification

PENDAHULUAN
Manusia dalam hidupnya selalu
membutuhkan nutrisi untuk dapat tumbuh dan
berkembang. Nutrisi dapat diperoleh dari
berbagai bahan makanan. Pada umumnya
bahan makanan mengandung tiga kelompok
utama senyawa kimia, yaitu karbohidrat,
protein, dan lemak. Protein merupakan suatu
senyawa yang terdapat dalam semua jaringan
hidup baik tumbuhan maupun hewan. Fungsi
biologis protein sangat beragam, antara lain
sebagai pembangun, pengatur, pertahanan, dan
sebagai sumber energi. Protein tergolong
senyawa makromolekul polimer yang
terbentuk melalui reaksi kondensasi asam-
asam amino sebagai monomernya (Frieda,
dkk. 2002).
Asam amino memiliki peranan yang
penting bagi kehidupan manusia. Mulai dari
memastikan bahwa pembelahan sel terjadi
dengan sempurna, fungsi-fungsi metabolisme,
memelihara daya ingat, pertumbuhan,
penyembuhan hingga sebagai bangunan blok
protein yang linear dari rantai asam amino.
Banyaknya manfaat dari asam amino dalam
tubuh, sehingga diperlukan suatu analisis
untuk mengidentifikasi keberadaan asam
amino yang terkandung dalam suatu sampel.
Salah satu cara untuk mengidentifikasi asam
amino adalah teknik kromatografi kertas.
Teknik pemisahan kromatografi ini
pertama kali diperkenalkan oleh Michael
Tswet (1906) seorang ahli botani dari Rusia.

Kromatografi berasal dari kata
bahasa Yunani kedua kata tersebut
berarti “warna” dan “menulis”. Pengertian
kromatografi
menyangkut metode pemisahan yang
didasarkan atas distribusi diferensial
komponen sampel diantara dua fase, yaitu fase
diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile
phase). Fase gerak akan membawa komponen
yang dapat mengakibatkan pergerakan
diferensial dari komponen. Fase diam dapat
berupa padatan atau cairan yang terikat pada
permukaan padatan (kertas atau suatu
adsorben), sedangkan fase gerak dapat berupa
cairan yang disebut dengan eluen atau pelarut,
atau gas pembawa yang inert. Gerakan fase
gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi
diferensial komponen-komponen dalam
sampel (Tika,2010).
Keuntungan pemisahan dengan
metode kromatografi dibandingkan dengan
metode pemisahan lainnya adalah
kromatografi dapat digunakan untuk sampel
atau konstituen yang sangat kecil (semi mikro
dan makro), cukup selektif terutama untuk
senyawa senyawa organik multi komponen,
proses pemisahan dapat dilakukan dengan
waktu yang relatif singkat, harganya murah
dan sederhana, karena umumnya tidak
memerlukan alat yang mahal dan rumit
(Soebagio, dkk., 2000).
Dalam kromatografi selalu terjadi
kecenderungan sebagai berikut: (a)
kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk melarut dalam cairan, (b)
kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk melekat pada permukaan padatan halus
(adsorpsi = penyerapan), (c) kecenderungan
molekul-molekul komponen untuk bereaksi
secara kimia (penukar ion), dan (d)
kecenderungan molekul-molekul tereklusi
pada pori-pori fase diam (Tika, 2010).
Teknik kromatografi ada berbagai
macam, salah satunya adalah kromatografi
kertas. Kromatogarfi kertas merupakan bentuk
kromatografi yang paling sederhana, mudah
dan murah. Jenis kromatografi ini merupakan
bidang khusus kromatografi cair-cair.
Kromatografi kertas merupakan salah satu
“chroma” dan “graphein”. Dalam
jenis kromatografi yang memiliki fase diam
dan fase gerak berupa cairan yang tidak saling
bercampur. Fase diam dalam kromatografi
berupa air yang terikat selulosa kertas
sedangkan fasa geraknya berupa pelarut
organik non polar. Berdasarkan kedua hal itu
kromatografi kertas dapat digolongkan ke
dalam kromatografi partisi. Dalam
kromatografi kertas fasa gerak akan merembes
ke dalam kertas karena efek kapiler. Rembesan
fasa gerak pada kertas dapat dilakukan dengan
teknik menaik (ascending) atau dengan teknik
menurun (descending). Pada teknik ascending
rembesan fasa gerak bergerak ke atas
sedangkan pada teknik descending rembesan
fasa gerak bergerak ke bawah. Pada teknik
menurun rembesan fasa gerak disamping
bergerak karena efek kapiler juga dibantu oleh
efek gravitasi sehingga rembesan berjalan
lebih cepat. (Soebagio, dkk., 2000)
Kromatografi kertas ini sangat
berguna untuk pemisahan zat anorganik,
organik, dan biokimia dalam jumlah yang
sedikit. Dalam percobaan ini dilakukan
analisis secara kualitatif terhadap larutan yang
mengandung bermacam-macam asam amino.
Kromatografi kertas dapat dilakukan secara
satu dimensi atau dua dimensi. Apabila macam
komponen tidak terlalu banyak, maka cara dua
dimensi seringkali diperlukan. Untuk itu
diperlukan dua macam larutan eluen, yang satu
diperlukan untuk ke satu arah, dan yang kedua
diperlukan untuk ke arah lain yang tegak lurus
pada arah elusi, setelah kromatografi kering.
(Tika 2010)
Kromatografi kertas sangat berguna
dalam biokimia, mengingat dalam praktikum
biokimia sering kali dijumpai sampel-sampel
kecil dan kompleks. Campuran asam-asam
amino sederhana dapat dipisahkan dengan
eluen fenol jenuh sebagai pengembang.
Sebagai fase diam, pada umumnya air yang
terserap pada pori-pori kertas. Oleh karena itu,
fase diamnya bersifat sedikit polar. Apabila
diinginkan fase diam yang baik, maka
biasanya kertas kromatogram dikeringkan,
kemudian menggunakan fase diam seperti
glikol, formanida, dan juga alkohol.
Pelaksanaan pemisahan dengan
metode kromatografi kertas terbagi dalam tiga
tahap yaitu tahap penotolan cuplikan, tahap
pengembangan, dan tahap identifikasi. Pada
tahap penotolan kertas kromatografi yang
sudah disiapkan ditotolak larutan cuplikan
dengan menggunakan mikropipet atau pipa
kapiler pada garis yang sudah dibuat. Pada
tahap pengembangan, ujung kertas
kromatografi yang dekat garis awal yang telah
berisi totolan cuplikan dicelupkan ke dalam
pelarut (eluen) yang terdapat dalam bejana
kromatografi. Komponen-komponen cuplikan
akan terbawa oleh rembesan cuplikan.
Perbedaan kelarutan komponen-komponen
cuplikan dalam eluen akan mengakibatkan
kecepatan bergerak komponen-komponen
dalam kertas juga berbeda. Perbedaan
kecepatan bergerak komponen-komponen ini
lenih umum disebut migrasi diferensial. Hasil
pemisahan akan nampak sebagai noda-noda
berwarna pada kertas dengan jarak yang
berbeda-beda dari awal. Pada tahap
identifikasi atau penampakan noda, jika noda
sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan
ditentukan Rf-nya. Besaran Rf ( rate of flow)
menyatakan derajat retensi suatu komponen
dalam fasa diam. Keran itu, Rf juga disebut
faktor referensi atau faktor refensi ( Soebagio,
2000).
O O
H
OH
H2N C C
OH
(aq)
R
O O
O O
OH H H H
N N
OH (aq) H2 O
H (aq)
O O
Gambar 1. Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino
METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan
ini adalah 4 buah pipa kapiler, 1 buah ruang
Setiap komponen memiliki harga Rf
tertentu. Jarak yang ditempuh oleh setiap
senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak
tempuh pelarut/eluen didefinisikan sebagai Rf.
Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
Rf 
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar
Nilai Rf dari suatu senyawa pada sistem
kromatografi kertas bergantung pada banyak
variabel, di antaranya sistem pelarut,
temperatur, lamanya elusi, dan jenis kertas.
Karena dipengaruhi oleh banyaknya variabel,
maka Rf suatu senyawa yang sudah diketahui
dijadikan standar atau patokan untuk
menentukan Rf senyawa lainnya.
Dalam praktikum ini dilakukan
analisis secara kualitatif terhadap larutan yang
mengandung bermacam-macam asam amino.
Pengamatan yang dilakukan cukup sulit
mengingat asam amino yang terlarut tidak
menunjukkan warna tertentu. Untuk
mengantisipasi hal tersebut, maka setelah elusi
dihentikan, posisi eluen ditandai dengan
pensil, lalu kromatogram dikeringkan dan
selanjutnya disemprot dengan larutan
ninhidrin. Ninhidrin akan bereaksi dengan
asam amino menghasilkan senyawa berwarna,
umumnya berwarna cokelat dan ungu, dengan
reaksi sebagai berikut.
O OH
NH3(aq) CO2 RCHO
(g) (aq)
H
OH (aq) (aq)
O O
3H2O(l)
(aq) (aq)
O O
kromatografi, 1 buah gelas kimia 250 mL, 1
buah gelas kimia 100 mL, 2 buah batang
pengaduk, 1 buah spatula, 1 buah penggaris, 1
buah gunting, 1 buah pinset, 1 buah pemanas
listrik, 2 buah pipet tetes, 1 buah corong pisah
250 mL serta 1 set statif dan klem. Bahan yang
digunakan dalam percobaan ini adalah 100 mL
larutan n-butanol, 24 mL asam asetat glasial, 2
mL larutan glisin, 2 mL larutan triptofan, 2 mL
larutan leusin, 2 mL larutan tirosin, 2 mL
larutan metionin, masing-masing 2 mL larutan
unknown A, B dan C, 200 mL aquades dan
100 mL fenol 2,5% .
Prosedur Kerja
Pembuatan Larutan Eluen Campuran n-
Butanol
Sebanyak 100 mL larutan n-butanol
ditambahkan 100 mL aquades dan 24 mL
asam asetat glasial. Ketiga larutan tersebut
ditempatkan ke dalam corong pisah dan
dikocok. Kedua lapisan yang terbentuk
kemudian dipisahkan.
Penyiapan Kertas Kromatografi
Kertas kromatografi disiapkan dengan
ukuran yang disesuaikan dengan wadah
kromatografi. Pada bagian sekitar 1,5 cm dari
tepi bawah kertas ditandai dengan pensil.
Proses Kromatografi dengan Menggunakan
Eluen Fenol
Kertas kromatografi dengan ukuran 15
x 25 cm ditotolkan dengan larutan I, II, III, IV,
V, A, B dan C (larutan triptofan, leusin,
tirosin, metionin, glisin, larutan sampel A,
larutan sampel B dan larutan sampel C)
menggunakan pipet kapiler. Jarak totolan
antara satu dengan yang lain adalah 1,5 cm.
Perlu diperhatikan tiap tetesan harus
dikeringkan terlebih dahulu dengan diangin-
anginkan sebelum tetesan berikutnya
ditotolkan. Besar noda hendaknya jangan
melebihi 0,4 cm. Kertas dijaga bersih dan
sedapatnya tidak tersentuh jari. Selanjutnya,
kertas digantungkan dalam ruang kromatografi
selama beberapa jam agar elusi dapat berjalan.
Setelah larutan elusi berjalan kurang lebih 10
cm dari batas sampel, elusi dihentikan dan
kertas kromatografi dikeluarkan dari ruang
kromatografi. Kemudian, batas larutan
ditandai dengan pensil dan kertas kromatografi
dikeringkan pada suhu 100-105oC. Setelah itu,
kertas yang telah dikeringkan disemprot
dengan larutan ninhidrin yang selanjutnya
dikeringkan kembali dalam oven. Kemudian,
diukur jarak eluen dengan jarak warna yang
dibentuk.
Proses Kromatografi Dengan Menggunakan
Eluen Campuran N-Butanol, Aquades dan
Asam Asetat Glasial
Siapkan kertas kromatografi dengan
ukuran 15 x 25 cm dan ditandai dengan pensil
1,5 cm dari tepi bawah. Kemudian, dengan
pipa kapiler ditotolkan larutan standar asam
amino dan sampel berdampingan dengan jarak
1,5 cm. Larutan ujung terletak 2 cm dari
pinggir kertas. Setelah itu, tiap-tiap tetesan
harus dikeringkan dulu, misalnya dengan alat
pengering rambut. Haruslah diusahakan
supaya cukup asam amino ditempatkan pada
kertas tersebut. Sedangkan besar noda
hendaknya jangan melebihi diameter 0,4 cm.
hendaknya kertas juga bersih dan sedapat
mungkin jangan disentuh oleh jari, gunakan
pinset. Karena diyakinkan ruang kromatografi
telah jenuh oleh uap eluen. Kemudian kertas
tersebut digantungkan dalam ruang
kromatografi dan dicelupkan tepi bawah kertas
kromatografi dalam eluen, usahakan jangan
sampai totolan asam amino standar dan sampel
terendam oleh eluen. Elusi asam amino standar
dan sampel kira-kira eluen menempuh jarak 10
cm. Elusi dihentikan dan ditandai jarak yang
ditempuh oleh eluen dengan pensil. Kertas
kromatografi selanjutnya dikeringkan pada
suhu 105-110oC. Kemudian kertas disemprot
dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan
kembali pada suhu 105-110oC selama 5 menit.
Noda-noda asam amino yang akan terlihat.
Selanjutnya dapat dihitung harga Rf-nya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Praktikum dengan menggunakan
teknik kromatografi kertas didasarkan atas
distribusi diferensial komponen sampel
diantara dua fasa. Kromatografi kertas
melibatkan dua fasa yang terdiri dari fasa diam
(stationary phase) dan fase gerak (mobil
phase). Fasa diam dalam kromatografi kertas
berupa air sedangkan fasa geraknya berupa
pelarut organik non polar. Praktikum
kromatografi kertas ini dilakukan untuk
menentukan asam amino yang terdapat pada
campuran asam amino dengan
membandingkan harga Rf masing-masing
asam amino yang terdeteksi pada sampel
dengan standar. Teknik kromatografi kertas
yang digunakan adalah teknik rembesan
menaik (ascending). Pada teknik ascending,
campuran pelarut (eluen) akan bermigrasi
melewati noda (spot) dengan arah ke atas.
Pada percobaan ini digunakan dua eluen yaitu
eluen fenol dan eluen campuran n-butanol,
asam asetat glasial dan aquades.
Campuran eluen n-butanol, asam
asetat glasial, dan akuades dibuat dengan
mencampurkan ketiga larutan tersebut ke
Gambar 2. Campuran n-butanol, asam asetat glasial dan akuades
membentuk dua lapisan
Terbentuknya dua lapisan ini disebabkan
karena ketiga larutan tidak bercampur secara
sempurna. Hal ini disebabkan karena air dan
asam asetat dapat bercampur secara sempurna
dikarenakan ke dua senyawa tersebut adalah
kovalen polar. Demikian juga, dengan n-
butanol dan asam asetat dapat bercampur
sempurna ke dua-duanya sama-sama
merupakan senyawa organik. Sedangkan air
dan n-butanol hanya bercampur sebagian
sehingga ketika campuran tersebut didiamkan
setelah dikocok, terlihat adanya dua lapisan.
Asam asetat ditambahkan dalam
pembuatan eluen ini bertujuan untuk
mendistribusikan kedua pelarut yang tidak
saling bercampur. Larutan n-butanol dan air
sama-sama dapat terdistribusi dalam asam
asetat sehingga dengan ditambahkannya asam
asetat glasial pada perbandingan volume
tertentu dapat diperoleh campuran atau cairan
yang mengandung n-butanol-asam asetat dan
air. Pengocokan dilakukan dengan tujuan
untuk lebih menyempurnakan distribusi antara
ketiga cairan tersebut. Dalam hal ini, n-butanol
sebagai pelarut nonpolar bertindak sebagai
fase gerak, dan air (pelarut polar) bertindak
sebagai fase diam.
Air sebagai fasa diam umumnya
terserap pada pori-pori kertas. Oleh karena itu
fasa diam bersifat polar. Molekul air sebagai
fasa diam yang polar akan terdistribusi pada
permukaan kertas, interaksi ini merupakan
efek yang sangat penting selama proses
dalam corong pisah dan dikocok terbentuk
campuran yang berwarna keruh. Setelah
didiamkan terbentuk dua lapisan. Lapisan atas
berupa cairan yang berwarna keruh, sedangkan
lapisan bawah berupa cairan bening tak
berwarna (gambar 2).
kromatografi kertas. Molekul air sebagai fasa
diam yang teradsorpsi pada permukaan kertas
menghasilkan ribuan tetes kecil sehingga
memungkinkan air bertindak sebagai fasa
diam. Fasa diam yang teradsorpsi akan
dilewati oleh fasa gerak yaitu komponen non
polar dari eluen (n-butanol) atau fenol (non
polar). Hal ini mengakibakan terjadi partisi
atau pemisahan campuran karena adanya
perbedaan distribusi asam amino yang
menyusun campuran asam amino dalam fasa
gerak dan air sebagai fasa diam.
Praktikum dengan menggunakan
kertas kromatografi harus benar-benar terjaga
kebersihan kertasnya. Kertas kromatografi
yang digunakan dihindarkan dari kontak
langsung dengan tangan, sedapat mungkin
tidak tersentuh oleh tangan, tetapi dipegang
dengan menggunakan penjepit atau
melengkapi tangan dengan menggunakan slop
tangan. Apabila terjadi kontak antara tangan
dengan kertas kromatografi maka
kemungkinan dapat mengganggu proses
kromatografi. Tangan seringkali dalam
keadaan lembab karena mengeluarkan keringat
sebagai hasil pengeluaran dari tubuh manusia.
Keringat ini mengandung minyak dan urea
yang merupakan zat organic sehingga
kemungkinan senyawa-senyawa organik
tersebut akan ikut bermigrasi sebagai fase
nonpolar (fase gerak). Hal inilah yang
nantinya akan dapat mempengaruhi proses dan
hasil dari kromatografi.
 Wadah kromatografi yang akan
digunakan terlebih dahulu harus dijenuhkan
dengan eluen. Pada tahap pertama, wadah
kromatografi dijenuhkan dengan eluen fenol.
Proses penjenuhan dilakukan dengan
memasukkan eluen fenol ke dalam wadah
kromatografi dan ditutup. Penjenuhan
bertujuan untuk mempersiapkan kondisi agar
kromatografi dapat berjalan lebih cepat. Hal
ini dikarenakan ketika udara dalam
kromatografi sudah jenuh begitu pula dengan
kertasnya maka ketika elusi sampel dimulai,
eluen tersebut akan fokus bekerja untuk
mengelusi komponen sampel.
Tahap pertama adalah penotolan asam
amino dan sampel pada kertas kromatografi
yang menggunakan pipa kapiler. Penggunaan
pipa kapiler dalam penotolan bertujuan agar
asam amino dan sampel pada kertas
diameternya tidak melebihi 0,4 cm. Apabila
diameter totolan melebihi 0,4 cm,
Gambar 3. Totolan Dikeringkan dengan Cara Diangin-Anginkan
Tahap selanjutnya adalah tahap
pengembangan. Pada tahap pengembangan,
kertas kromatografi yang sudah berisi larutan
yang akan diuji dimasukkan ke dalam wadah
kromatografi yang sudah dijenuhkan dengan
eluen fenol. Pencelupan diusahakan tidak
Gambar 4. Kertas Kromatografi Dimasukkan ke dalam
Cember Kromatografi
Komponen-komponen larutan yang diuji akan
terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan
kelarutan komponen-komponen larutan yang
diuji dalam eluen akan mengakibatkan
kemungkinan akan terjadi perembesan dari
fase gerak dan fase diamnya sehingga menjadi
tidak jelas karena warna yang terdeteksi terlalu
menyebar dan menggangu hasil pengamatan
sehingga sulit untuk menghitung harga Rf-nya.
Kertas kromatografi yang digunakan pada
percobaan ini berjumlah dua lembar. Tujuan
digunakan kertas kromatografi dua lembar
agar jarak totolan antar larutan yang akan diuji
lebih jauh sehingga akan lebih mudah dalam
mengamati rembesan noda-noda dari larutan
yang diuji. Kertas kromatografi pertama berisi
larutan asam amino yang terdiri dari larutan
triptofan, leusin, tirosin, dan glisin, sedangkan
untuk kertas kromatografi kedua berisi larutan
glisin, sampel A, sampel B, dan sampel C.
Setiap menotolkan larutan yang akan diuji,
totolan tersebut dikeringkan dengan cara
diangin-anginkan terlebih dahulu kemudian
dilanjutkan dengan menotolkan kembali
larutan asam amino lain yang akan diuji
(gambar 3).
merendam totolan asam amino dan sampel
atau garis awal. Setelah kertas kromatografi
dicelupkan, eluen langsung merembes
melewati totolan larutan yang diuji (gambar
4).
kecepatan bergerak komponen-komponen
dalam kertas juga berbeda. Perembesan
dihentikan setelah eluen hampir bergerak
sekitar ±10 cm. Setelah eluen bergerak
bergerak sekitar ±10 cm, kertas kromatografi pengamatan karena ninhidrin akan
dikeluarkan dari wadah kromatografi. memberikan warna apabila bereaksi dengan
asam amino. Namun, warna tidak langsung
Pada tahap identifiksi atau muncul ketika disemprotkan ninhidrin karena
penampakann noda, jarak tempuh eluen yang diduga masih terdapat molekul-molekul air
ditempuh ditandai dengan pensil dan kertas yang teradsorpsi sehingga ninhidrin tidak
dikeringkan pada suhu 100-105oC. Hal ini dapat bereaksi sempurna dengan asam amino
dikarenakan pada suhu ini molekul air akan yang terdistribusi pada fase polar (air) dan fase
menguap. Setelah dikeringkan belum ada gerak (n-butanol). Untuk mengatasi hal
penampakan noda sehingga untuk tersebut, kertas dikeringkan kembali di atas
menampakan noda tersebut dilakukan pemanas listrik. Setelah kering, timbul warna
penyemprotan kertas dengan larutan ninhidrin. berupa bercak-bercak ungu yang
Tujuan disemprotkan larutan ninhidrin pada mengindikasikan adanya asam amino (gambar
kertas kromatografi untuk memudahkan 5).

(a) (b)
Gambar 5. (a)Warna noda ungu pada kromatografi larutan I, II, III, dan IV dengan eluen
fenol, (b) warna noda ungu pada kromatografi larutan V, A, B dan C dengan eluen
fenol

Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dengan asam amino adalah sebagai berikut.
O O
H
OH O OH
H2N C C NH3(aq) CO2 RCHO
(g) (aq)
OH H
(aq) OH (aq) (aq)
R
O O

O O
O O
OH H H H

N N 3H2O(l)
OH (aq) H2 O (aq) (aq)
H (aq)
O O
O O

Gambar 6. Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino

Setelah timbul warna maka Rf dapat dihitung senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak
sebagai jarak yang ditempuh asam amino tempuh pelarut/eluen, dengan rumus sebagai
berbanding dengan jarak yang ditempuh eluen. berikut.
Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh setiap
Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
Rf 
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar
Untuk mengidentifikasi jenis asam unknown A, B, dan C dapat dilakukan dengan
amino apa saja yang terdapat pada sampel membandingkan nilai Rf larutan sampel A, B,
dan C dengan Rf standar yaitu dari larutan kertas dengan menggunakan eluen fenol serta
asam amino triptofan, leusin, tirosin metionin nilai Rf nya adalah sebagai berikut.
dan glisin. Data hasil praktikum kromatografi
Tabel 1. Data hasil kromatografi dengan eluen fenol

Asam Amino Jarak Tempuh Eluen Jarak Tempuh Komponen Rf

(cm) (cm)
Triptofan 12,8 7,1 0,55
Leusin 12,8 11,9 0,93
Tirosin 12,8 1,8 0,14
Metionin 12,8 11,5 0,89
Glisin 14,5 11,3 0,78
Sampel Unknown A 14,5 13,3 0,92
14,5 12,2 0,84
14,5 7,6 0,52
Sampel Unknown B 14,5 13,0 0,89
Sampel Unknown C 14,5 10,8 0,75

Dalam menentukan asam amino yang leusin, metionin dan triptofan. Selanjutnya
ada pada sampel unknown digunakan selisih nilai Rf dari sampel B mendekati nilai Rf dari
Rf paling kecil yang merupakan asam amino asam amino metionin sehingga sampel B
yang dimaksud. Berdasarkan data di atas, diduga mengandung asam amino metionin.
dapat diketahui bahwa sampel A pada eluen Sampel C memiliki nilai Rf mendekati nilai Rf
fenol memiliki nilai Rf yang mendekati leusin, dari asam amino glisin sehingga sampel C
metionin, dan triptofan. Bila dilihat dari selisih diduga mengandung asam amino glisin.
antara Rf sampel A dengan Rf dari larutan Adapun data selisih Rf Sampel Unknown
leusin, metionin, dan triptofan memiliki nilai dengan Rf Standar pada Eleuen fenol sebagai
yang lebih kecil (paling mendekati) sehingga berikut.
sampel A diduga mengandung asam amino
Tabel 2.Data Selisih Rf Sampel Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen fenol

Sampel Selisih Rf sampel dengan Rf asam Hasil

amino standar
Sampel Unknown A 0,93 - 0,92 0,01 (Leusin)
0,89 - 0,84 0,05 (Metionin)
0,55 - 0,52 0,03 (Triptofan)
Sampel Unknown B 0,89 - 0,89 0,00 (Metionin)
Sampel Unknown C 0,78 - 0,75 0,04 (Glisin)

Percobaan yang kedua dilakukan kertas kromatografi pada percobaan

kromatografi kertas dengan menggunakan
eluen campuran n-butanol, akuades, dan asam
asetat glasial. Pada eluen n-butanol wadah
kromatografi juga dilakukan penjenuhan,
dengan memasukkan eluen n-butanol serta
campurannya. Kromatografi menggunakan
eluen n-butanol tekniknya sama dengan
kromatografi menggunakan eluenn fenol.
Setelah proses kromatografi selesai, kertas
kromatografi juga diperlakukan sama seperti
menggunakan eluen fenol yaitu mengeringkan
di atas pemanas listrik dan setelah kering
disemprot dengan larutan ninhidrin. Kemudian
dikeringkan kembali di atas pemanas listrik.
Setelah dikeringkan timbul warna ungu
(gambar 7), kemudian diukur jarak tempuh
eluen dan jarak sampel masing-masing asam
amino serta sampel A,B, dan C yang terdapat
pada kertas kromatografi.
 (a) (b)
Gambar 7. (a) Warna noda ungu pada kromatografi larutan I, II, III dan IV dengan eluen campuran
n-
butanol, dan (b) warna noda ungu pada kromatografi larutan V, A, B dan C dengan eluen
campuran n-butanol

Jarak tempuh eluen dan larutan sampel setelah dilakukan pengukuran pada masing-masing
kertas didapatkan data sebagai berikut.

Tabel 3. Data hasil kromatografi dengan eluen n-butanol

Asam Amino Jarak Tempuh Eluen Jarak Tempuh Komponen Rf

(cm) (cm)
Triptofan 10 5,9 0,59
Leusin 10 7,0 0,70
Tirosin 10 2,1 0,21
Metionin 10 4,2 0,42
Glisin 10 2,0 0,20
Sampel Unknown A 10 5,0 0,50
10 3,0 0,30
10 1,6 0,16
Sampel Unknown B 10 4,8 0,48
10 1,2 0,12
Sampel Unknown C 10 5,8 0,58
10 2,5 0,25

Untuk mengetahui kandungan asam
amino pada sampel dilakukan perhitungan
selisih nilai Rf sampel dengan nilai Rf larutan
asam amino standar pada eluen campuran n-
butanol, asam asetat glasial, dan aquades .
Dalam menentukan asam amino yang ada pada
sampel unknown digunakan selisih Rf paling
kecil yang merupakan asam amino yang
dimaksud. Berdasarkan data di atas,dapat
diketahui bahwa sampel A pada eluen
campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan
aquades memiliki nilai Rf yang mendekati
triptofan, metionin, dan glisin. Bila dilihat
dari selisih antara Rf sampel A dengan Rf dari
larutan triptofan, metionin, dan glisin memiliki
nilai yang lebih kecil (paling mendekati)
sehingga sampel A diduga mengandung asam
amino triptofan, metionin dan glisin.
Selanjutnya nilai Rf dari sampel B mendekati
nilai Rf dari asam amino metionin dan glisin
sehingga sampel B diduga mengandung asam
amino metionin dan glisin. Kemudian nilai Rf
dari sampel C sama dengan nilai Rf dari asam
amino triptopan dan glisin sehingga sampel C
diduga mengandung asam amino triptopan dan
glisin. Adapun data selisih Rf Sampel
Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen
campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan
aquades sebagai berikut.
 Tabel 4. Data Selisih Rf Sampel Unknown dengan Rf Standar pada Eleuen n-butanol
Sampel Selisih Rf nilai Rf sampel dengan Hasil
asam amino standar
Sampel Unknown A 0,59 - 0,50
0,42 - 0,30
0,20 - 0,16
Sampel Unknown B 0,48 - 0,42
0,20 - 0,12
Sampel Unknown C 0,59 – 0,58
0,25 – 0,20
Berdasarkan data yang didapatkan
pada kedua eluen yang berbeda, diperoleh
bahwa sampel unknown A mengandung asam
amino leusin, triptofan, metionin, dan glisin.
Sampel B mengandung asam amino metionin
dan glisin, sedangkan pada sampel C
mengandung asam amino triptofan dan glisin.
Namun, terdapat perbedaan kandungan yang
ada dalam sampel unknown pada saat
menggunakan eluen fenol dan eluen campuran
n-butanol, asam asetat glasial, serta akuades
disebabkan karena eluen yang belum
terdistribusi secara maksimal sehingga
pemisahan belum terjadi secara sempurna.
Terjadi sentuhan atau gesekan antar
kromatogram ketika proses elusi, sehingga
berdampak pada kesulitan dalam
mengidentifikasi zat yang terkandung dalam
sampel. Selain itu juga karena ketidaktepatan
saat menotolkan larutan pada kertas
kromatografi yang seharusnya pentotolan
larutan tidak melebihi diameter 0,4 cm.
Dengan demikian pada eluen fenol distribusi
noda asam amino yang terkandung pada
sampel unknown sulit untuk diidentifikasi. Hal
inilah menjadi penyebab perbedaan asam
amino yang didapatkan pada sampel unknown
antara menggunakan elun fenol dan eluen n-
butanol.
SIMPULAN
Berdasarkan pembahasan di atas dapat ditarik
simpulan sebagai berikut:
1. Perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari
asam amino triptofan, leusin, tirosin,
metionin dan glisin dalam eluen fenol
berturut-turut: 0,554, 0,92, 0,14, 0,89, dan
0,78. Perbandingan koefisien distribusi
(Rf) dari asam amino triptofan, leusin,
tirosin, metionin dan glisin dalam eluen n-
butanol berturut-turut: 0,59, 0,7, 0,21,
0,42 dan 0,2.
0,09 (Triptofan)
0,12 (Metionin)
0,04 (Glisin)
0,06 (Metionin)
0,08 (Glisin)
0,01 (Triptofan)
0,05 (Glisin)
2. Sampel unknown A mengandung asam
amino leusin, triptofan, glisin dan
metionin, sampel unknown B mengandung
asam amino metionin dan glisin, dan
sampel unknown C mengandung asam
amino glisin dan triptofan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
dosen pengampu mata kuliah Praktikum
Biokimia atas bimbingan dan masukan selama
praktikum ini, Kadek Dewi Wirmandianthy,
S.Pd, M.Si selaku asisten dosen, dan I Dewa
Subamia selaku laboran di Jurusan Pendidikan
Kimia atas bantuan dalam memberikan segala
keperluan yang berkaitan dengan praktikum
sehingga percobaan ini dapat dilaksanakan
dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II.
Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu
Pendidikan Negeri Singaraja.
Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum
Biokimia. Singaraja : Universitas
Pendidikan Ganesha
Soebagio,dkk. 2000. Kimia Analitik II.
Malang: Universitas Negeri Malang.
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum
Biokimia. Singaraja: Universitas
Pendidikan Ganesha