KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Thin Layer Chromatography (TLC)

PROGRAM STUDI D-IV ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF.DR.HAMKA
2019
 Anggota Kelompok 4 :

1. MUHAMMAD RIZKY (1804034063)

2. MAULIDYA JULIANE (1804034064)
3. DEWI HANDAYANI (1804034065)
4. NIA NURREVI (1804034066)
5. IRFA RAHMA (1804034067)
KROMATOGRAFI????

Kromatografi adalah teknik

pemisahan campuran
didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-
komponen campuran
tersebut diantara dua fase.
KLT merupakan salah satu metode
isolasi yang terjadi berdasarkan
perbedaan daya serap (adsorpsi) dan
daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang
akan bergerak mengikuti kepolaran
Sejarah Kromatografi Lapis Tipis
1906: Michael Tswer (ahli botani Rusia) memperkenalkan
krpmatografi.
1938: N.A Ismailov dan M.S Shcraiber memperkenalkan
teknik KLT, meneteskan alkohol ke ekstrak tanaman medis
pada lapisan kering.
1947: digunakan lapis tipis yang disokong dengan kaca
berpori
1956: ditemukan metoda fasa diam dan fasa gerak, KLT
mulai berkembang.
1958: KLT masih kalah dibanding GC, KLT mulai
diperkenalkan kembali dan dilakukan penelitian lebih dalam
selama 5 tahun.
1965: lebih dari 45.000 publikasi ilmiah menggunakan KLT
Penggunaan KLT
1.Untuk penentuan jumlah komponen dalam
campuran.
2. Untuk penentuan identitas antara dua
campuran.
3. Untuk memonitor perkembangan reaksi.
4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
5.Untuk menentukan pelarut yang sesuai untuk
pemisahan kolom
6. Untuk memantau kemajuan kromatografi kolom .
Pada KLT, identifikasi senyawa dapat dilakukan dengan
menghitung harga Rf
Rf pembanding vs Rf sampel

Harga Rx atau Rstd =

Jarak yang ditempuh senyawa yang tidak diketahui
Jarak yang ditempuh senyawa standart yang diketahui

Harga Rf dipengaruhi oleh :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
2. Sifat penyerap dan derajad aktivitasnya
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
4. Pelarut (dan derajad kemurniannya) fasa bergerak
5. Derajad kejenuhan dalam uap
6. Teknik percobaan
7. Jumlah cuplikan yang digunakan
8. Suhu
9. Kesetimbangan
Prinsip Kerja KLT
Pada proses pemisahan dengan kromatografi
lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan
antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada
interaksi antara permukaan fase diam dengan
gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan
fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi
oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam,
kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan
ukuran molekul.
Alat-alat
Plat

Syarat plat yang baik:

 Harus bersifat inert
 Terbuat dari kaca, aluminium, dan plastik
Pemilihan berdasarkan temperatur operasi
dan jenis pelarut
Plat kaca
Plat Kertas
Fasa Diam (adsorben/lapisan penyerap)

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan

penyerap berukuran kecil dengan diameter
partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran
rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit
kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik
kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Fase diam yang biasa digunakan

•Silika gel
•Alumina
•Magnesium Trisilikat
•Kalsium Sulfat(K2SO4)
•Kieselghur
•Selulosa
 Sifat-sifat dasar beberapa adsorben
untuk TLC
Adsorben Keasaman Aktivitas Efek Senyawa Yang
Pemisahan Dapat
Dipisahkan
Silika gel Asam Aktif Adsorbsi + Hampir semua
Partisi zat
Alumina Basis Aktif Adsorbsi + Steroid,
Partisi senyawa
bersifat basis
Magnesium - Lemah Adsorbsi Karetonoid,
Trisilikat toko ferol
Kalsium Sulfat - Lemah Adsorbsi Asam lemak,
(K2SO4) gliserida
Kieselghur Netral Inaktif Partisi Gula,
farmasetika
Fase Gerak

 Petroleum eter
 Petroleum dietileter
 Metanol
 Etil asetat
 Kloroform CHCl3 / 119,38
 Asetonitril
 Benzena C6H6 / 78,11
 Karbon tetraklorida CCl4 / 153,82
Bagaimana mendapatkan komposisi fase gerak (eluen)
yang baik untuk KLT????

1. Cari di pustaka (jika ada)

2. Jika tidak ada, cari yang sifatnya mirip
3. Jika tidak ada yang mirip lakukan percobaan
a. Lakukan eluasi dengan fase gerak paling non polar
b. Lakukan kenaikan kepolaran secara gradien
c. Evaluasi hasil, dan tentukan komposisi yang paling
baik
Penampak Bercak kimia, berdasarkan sifatnya:
1. Permanen: Asam sulfat pekat dan ninhidrin
2. Sementara: Uap Iodium

Penampak Bercak kimia, berdasarkan spesifisitasnya:

1. Spesifik:
ninhidrin: untuk zat dengan atom N (protein,
Alkaloid dll)
2. Umum:
Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir semua zat)
 Analisis Sampel yang Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis
tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana

bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak
berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika
sinar UV diberikan pada lempengan, akan
timbul pendaran dari posisi yang berbeda
–Ultraviolet light at 254 nm
dengan posisi bercak-bercak. Bercak
(shortwave UV).
tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
–Long wave UV (340 nm) is
used less commonly.
2. Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-
bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan
zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna.
Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan
dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan

larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino
menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat
atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan

kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas
kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada sebelum setelah
kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak disemprot disemprot
ninhidrin ninhidrin
daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai
bercak-bercak kecoklatan.
Teknik Standard Pemisahan KLT
1. Lapisan tipis adsorben dibuat pada permukaan plat kaca atau
plat lain
2. Tebal lapisan adsorben tergantung penggunaan, biasanya 250
mikro
3. Larutan campuran senyawa yang akan dipisahkan diteteskan
pada kira-kira 1,5 cm dari bagian bawah plat dengan pipet
mikro atau syringe
4. Zat pelarut yang terdapat pada sampel yang diteteskan,
kemudian diuapkan lebih dahulu
5. Plat kromatografi dikembangkan dengan mencelupkan pada
tangki yang berisi campuran zat pelrut
6. Tinggi permukaan zat pelarut dalam tangki harus lebih
rendah dari letak tetesan sampel pada plat kromatografi
7. Masing-masing komponen senyawa dalam sampel akan
bergerak ke atas dengan kecepatan yang berbeda
8. Mulai pemilihan adsorben sampai identifikasi masing-masing
komponen yang telah terpisah
Metode Pengembangan (Development) pada
KLT

Berdasar arah pengembangan

 Menaik
 Menurun

Berdasarkan Dimensi
 Pengembangan 1 dimensi
> 1 tahap
> lebih dari 1 tahap
 Pengembangan 2 dimensi
Metode normal Pengembangan plat KLT
peralatan untuk penjenuhan plat KLT
Efek Penjenuhan plat pengembangan plat
Berdasarkan jenis fase, pengembangan dibagi:
•Fase normal adalah istilah yang digunakan ketika fase diam
adalah kutub ; untuk gel silika misalnya , dan fase gerak
adalah pelarut organik atau campuran pelarut organik yang
kurang polar daripada fase diam .
•Fase terbalik adalah istilah yang digunakan ketika fase
diam adalah silika terikat dengan substrat organik seperti
rantai panjang asam alifatik seperti C - 18 dan fase gerak
adalah campuran air dan pelarut organik yang lebih polar
daripada fase diam .

Contoh fase normal: KLT dengan fase diam Silika

dan fase gerak petroleum eter
Contoh fase terbalik: KLT dengan fase diam C-18
dengan fase gerak metanol
 Kelebihan KLT
1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi
warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3.Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
4.Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
5.Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7. Jumlah perlengkapan sedikit.
8. Preparasi sample yang mudah
9.Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon)
yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).
10. Waktu analisis singkat
Kekurangan KLT
1.Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra
untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.
2.Butuh sistem trial and eror untuk
menentukan sistem eluen yang cocok.
3.Memerlukan waktu yang cukup lama
jika dilakukan secara tidak tekun