KROMATOGRAFI GEL

sani.widyastuti@gmail.com
 KROMATOGRAFI GEL

Nama lain : Kr. Saringan Gel (Gel Filtration chr.)

Kr. Eksklusi (Exclusion Chr.)
Kr. Permeasi Gel (Gel Permeation Chr.)
Molecular Sieve Filtration.
Restrited Diffsion Chromatogr.
Dasar Pemisahan
Perbedaan ukuran molekul
 PROSES PEMISAHAN

@ Gel terdiri atas makromolekul ikatan silang, membentuk

jaringan tiga dimensi, tidak bermuatan.
@ Gel mengembang dalam pelarut (fasa gerak) yang
berperkolasi melalui alas kromatografi (gel).
@ Mekanismenya merupakan partisi keadaan khusus.
@ Sampel yang terdiri atas campuran molekul kecil, sedang,
dan besar ditaruh di atas kolom.
@ Molekul-molekul kecil dapat masuk ke dalam alas gel dan
molekul-molekul besar tak dapat masuk sehingga keluar
dari kolom paling dahulu.
 KROMATOGRAFI EKSKLUSI

@ Suatu mode pemisahan non-interaktif.

@ Partikel pengisi kolom mempunyai berbagai ukuran pori
dan berbagai jaringan pori.
@ Molekul solute ditahan atau dilewatkan berdasarkan
volum molekul hidrodinamik, yakni ukuran dan bentuk-
nya, tidak berdasarkan berat molekul.
@ Molekul-molekul besar tidak dapat (hanya sedikit) masuk
pori (excluded), berjalan di bagian luar gel dan terelusi
pada volume mati.
@ Molekul-molekul kecil berdifusi ke dalam pori-pori yang
dapat dimasukinya, dan keluar dari kolom paling akhir.
 KROMATOGRAFI EKSKLUSI

@ Molekul-molekul berukuran sedang dapat menembus

sebagian pori-pori tapi tidak dapat menembus sebagain
lagi. Akibatnya mengalami hambatan dalam
pergerakannya dalam kolom dan keluar pada waktu
antara waktu molekul besar dan molekul kecil.

Gel Filtration : Untuk polimer yang larut dalam air

dan biopolimer.
Gel Permeation : Untuk polimer yang larut dalam
pelarut organik.
MEKANISME PEMISAHAN DENGAN GPC
 KLASIFIKASI GEL
1. GEL KAKU (RIGID)
Volume porinya uniform dan tetap.
Permeabilitas kolomnya tinggi.
Dapat dibasahi oleh air ataupun pelarut organik.
Contoh: silika atau gelas berpori.
2. SETENGAH KAKU ( SEMI RIGID)
Permebilitas kolom tinggi.
Dapat dibasahi oleh pelarut air.
Contoh: polistiren berikatan silang, resin penukar
ion, dan polivinil asetat.
 KLASIFIKASI GEL
3. GEL LUNAK
Memperlihatkan permeabilitas kolom.
Rentang permeabilitas tergantung pada besarnya
pengembangan (oleh) pelarut bila dimasukkan ke
dalam pelarut tersebut.
Contoh: - Dekstran berikatan silang (Sephadex).
- Kanji.
- Karet.
- Polistiren ikatan silang.
- Gel poliakrilamid.
 KEUNTUNGAN KROMATOGRAFI GEL
@ Mudah dikerjakan.
@ Tidak sensitif terhadap komposisi eluen.
@ Matriks gel tidak menyebabkan denaturasi (protein).
@ Dapat digunakan untuk BM 103 - 106 .
@ Gel sangat stabil dan dapat digunakan berulang-ulang.
 SYARAT-SYARAT GEL
@ Matriks dari gel harus inert.
@ Secara kimia stabil.
@ Kandungan gugus ionik rendah.
@ Ukuran partikel dan distribusinya harus terkontrol baik.
@ Kekakuan butiran gel harus setinggi mungkin.
PSDVD
GEL BERLANDASKAN SILIKA
JENIS/NAMA DIAMETER BATAS EKSKLUSI
PORI (A) BM

Gel Kaku
Gelas berpori 75 - 2.500 2.800 - 1.200.000
Silika berpori 150 - 1.000 50.000 - 1.000.000
(Merck-O-Gel)
Setengah Kaku
Polistern 2.400 - 400.000.000
Polivinil asetat 750 - 1.000.000
JENIS/NAMA DIAMETER BATAS EKSKLUSI
PORI (A) BM

Gel Lunak
1. Dekstran 700 - 200.000
Sephadex (8 jenis) 5.000 - 800.000
2. Poli akril amid 2.000 - 400.000
Biogel P (12 jenis)
3. Agarose 500.000 - 150.000.000
Biogel A (6 jenis)
4. Polistiren 1.700 - 35.000
Bio Beads
DIAMETER PORI RENTANG KERJA
(nm) (Dalton)

4 1.000 - 8.000
10 1.000 - 30.000
25 2.500 - 125.000
55 11.000 - 350.000
150 100.000 - 1.000.000
250 200.000 - 1.500.000
 PEMILIHAN GEL

Ada 2 macam pemisahan

1. Pemisahan ke dalam kelas -kelas (desalting).
Pemisahan zat BM tinggi dari zat BM rendah
Gel: Sephadex G-25, Sephades G-50, Biogel P-6, Biogel P-
10
2. Fraksionasi
Pemisahan zat-zat yang hampir sama terelusi berdekatan
satu sama lain.
Gel: Sephadex G-25, Sephadex G-100, Sephadex G-500
 PEMILIHAN GEL

Ukuran partikel
@ Umumnya 70 m
@ Makin halus (kecil), resolusi makin baik
 MEMILIH BAHAN PENGISI KOLOM
@ Jumlah puncak (zat) yang dapat dipisahkan oleh setiap
bahan dengan ukuran pori tertentu terbatas.
@ Tersedia di pasaran bahan pengisi kolom dengan
berbagai ukuran pori (50 - 106A).
@ Molekul yang akan dipisahkan dapat mempunyai BM
rendah ( 100) sampai BM tinggi (500 juta).
@ Pilihan bahan yang cocok untuk sampel campuran zat-
zat dengan perkiraan BM yang diketahui.
@ Rentang pemisahan berbagai bahan.
Rentang Pemisahan dan Batas Eksklusi Kolom TSK
 PENYIAPAN GEL

@ Serbuk gel kering dibirkan mengembang dalam cairan

fasa gerak.
@ Kesetimbangan dipercepat dengan pemanasan slurry
gel samapi 1000 C (water bath).
@ Pengepakan dilakukan setelah pengembangan
sempurna dan gel dingin.
@ Pengepakan cara kering tidak baik.
 PENYIAPAN GEL

KOLOM
@ Panjang 20 - 100 cm.
@ Diameter 1 - 3 cm.
@ Volume sampel 1-2% volume total gel (dalam desalting
sampai 25-30%).
 PELARUT

@ Umumnya pelarut tunggal.

@ Kemungkinan terjadi masalah viskositas tinggi.
@ Gel permeation : THF, kloroform, toluen (pemisahan
polimer sintetik).
@ Gel filtratioon : Air, bufer + modifier organik
(pemisahan biopolimer).
 DETEKTOR

@ Refraktometer diferensial.
@ Spektrofotmeter UV.
@ LALLS (Low Angle Laser Light Scattering) dapat
menentukan Bm absolut.
@ Infra red: Informasi komposisi polimer cabang dan
tacticity (keteraturan ruang).
 SUMBER KESALAHAN

@ Adanya tampat-tempat pada bahan pengisi kolom yang

bersifat mengadsorpsi dideaktifasi dengan
menggunakan fasa gerak polar seperti THF atau
memodifikasikannya secara kimia.
@ Terjadinya efek eksklusi ion bila permukaan pori
mengandung gugus bermuatan sama dengan muatan
solute (gaya tolak dikurangi dengan pemambahan
0,01 M NaCl)
@ Terjadinya efek inklusi ion, dalam kromatografi polielek-
trolit polidispers atau campuran garam yang berbeda
ukuran molekul.
 SUMBER KESALAHAN

Hal ini karena adanya eksklusi molekul besar

menyebabkan terjadinya kesetimbangan Donnan, yang
seterusnya menyebabkan konsentrasi molekul kecil yang
terinklusi menjadi besar dan meningginya volume
retensi.
Efek ini ditekan dengan penambahan elektrolit yang
cukup.
Kondisi Kromatografi
Kolom, Synchropak GPC 300 (7, 300 x 7,8 mm)
Sistem pelarut: KH2PO4 0,01 M pH 7,0
Kecepatan alir: 1,5 ml/menit.
Kromatogram
1
1. = DNA
2. = P-Amylase
3. = Ovalbumin
4. = Carbonic Anhidrase
5. = Pengotoran
6. = Glycyl Tyrosin
Contoh: Pemisahan protein standar (campuran fibrinogen,
albumin (sapi), - laktoglubulin, myoglobulin,
cytochromec dan glycyl-Tyrosine) (chromatog-
raphy, catalog No. 100, Alltech Associates).
Kondisi kromatografi
Kolom, Shodex Protein WS-802,5 (1 x (50 cm x 8 mm)).
Sistem pelarut, bufer tris HCl 0,05 M + KCl 0,1 M.
Kecepatan aliran 0,8 ml/menit.
Detektor: UV 280.
Terima Kasih