Size-Exclusion

Chromatography
Ahmad Bayu Satriawan 20720304
Husnunnisa 30730310
M. Ikhlas Arsul 30730311
 Definisi

● Suatu teknik kromatografi kolom cair yang memisahkan senyawa

berdasarkan ukuran molekul dalam sampel.
● Tujuan utama dan penggunaan teknik SEC adalah untuk
memberikan informasi distribusi berat molekul (MWD) suatu
sampel tertentu.
● SEC disebut juga gel permeation chromatography (GPC), gel
filtration chromatography (GFC)
● Prinsip SEC : Pemisahan senyawa berdasarkan ukuran molekul
dimana molekul dengan ukuran kecil berpenetrasi ke dalam pori-
pori fase diam, sedangkan molekul berukuran besar akan terelusi
lebih dahulu
 Mekanisme Pemisahan

Larutan sampel dimasukkan ke dalam

kolom, yang diisi dengan kemasan kolom
berpori oleh fase gerak. Molekul-molekul
kecil berdifusi ke dalam pori-pori fase diam
sesuai dengan ukurannya, sedangkan
molekul besar tidak masuk pori-pori dan
terelusi dalam volume kosong pada kolom.
Akibatnya, molekul terpisah berdasarkan
ukurannya saat melewati kolom dan dielusi
berdasarkan urutan berat molekul terbesar.
Instrumen SEC
● Penampung pelarut: terbuat dari kaca dengan kapasitas minimal 1 L Botol harus dilengkapi
dengan tutup ulir untuk mencegah kontaminasi debu dan meminimalkan penguapan.
● Pompa pelarut: Komponen ini menarik pelarut dari reservoir dan mengirimkannya ke kolom
dengan laju aliran konstan. Laju aliran harus akurat, dapat direproduksi, dan tidak berdenyut.
Pompa biasanya dibuat dari baja tahan karat, katup dan piston dari ruby atau safir, dan segel
dari polytetrafluoroethylene.
● Injektor: Injektor katup/loop adalah metode paling umum untuk memasukkan larutan sampel
ke dalam kromatografi cair melalui injektor katup/loop. Injektor septum konvensional yang
digunakan seperti GC dan HPLC. Namun, dibutuhkan jarum suntik cair bertekanan tinggi
khusus untuk mencegah kebocoran
● Kolom: ukuran kolom SEC semuanya sangat mirip. Terbuat dari stainless steel, diameter
dalam sekitar 8 mm dengan panjang 300 atau 600 mm. untuk penggunaan pelarut organic,
kolom dikemas dengan polimer stirena/divinilbenzena berpori. Untuk pemisahan berdasarkan
ukuran partikel, partikel kecil dan distribusi partikel yang sempit merupakan hal terpenting
dalam efisiensi kolom.
● Detektor: pemilihan detector berdasarkan dua kategori: yang mengukur perubahan densitas
bulk dari fase gerak, seperti RI atau viskositas, dan yang mengukur beberapa sifat khusus zat
terlarut, seperti UV atau inframerah.
● Preparasi sampel: Polimer harus dilarutkan dalam pelarut yang diambil dari kromatografi yang
digunakan. Konsentrasi larutan tergantung pada berat molekul sampel. Hal ini diperlukan
untuk mencegah aliran melalui kolom terhambat karena efek viskositas.
 Fase Diam

● Tidak berinteraksi dengan sampel.

● Dapat terbasahi oleh fase gerak namun tidak mengembang.
● Stabil pada temperature uji
● Memiliki berbagai ukuran pori sehingga dapat melakukan distribusi berat molekul yang
memadai pada sampel.
● Fase diam biasanya terdiri dari dekstrosa, agarose, poliakrilamid, atau silika dengan sifat fisik
yang berbeda.
● Ukuran pori : 60 – 4000 Å
● Ukuran partikel : 5 – 10 µm
 Fase Gerak

● Mampu melarutkan polimer sampel pada fase diam

● Viskositas rendah
● Efektif untuk mencegah polimer sampel berinteraksi kuat dengan
fase diam.
● Fase gerak dapat berupa larutan, larutan organik, atau larutan
buffer.
 Kolom

● Diameter : 7 – 8 µm (analitik), 20 – 25 µm (preparatif)

● Panjang : 20 – 60 cm
● Kemasan : porous silika, cross-linked gel
● Tidak boleh dipasang dalam keadaan terbalik,
● Tidak terdapat gelembung udara selama proses injeksi atau perakitan
 Kelebihan Kekurangan
● Waktu pemisahan cepat dan • Tidak dapat digunakan untuk ukuran
hasil baik sampel yang seragam.
● Frekuensi tajam dan sensitivitas
baik
● Sampel tidak berkurang karena
tidak berinteraksi dengan fase
diam
 SEC Selulosa

● Selulosa dan turunannya digunakan dalam produksi kertas; tekstil dan serat (misalnya, rayon);
film (misalnya, plastik); pengental (misalnya, selulosa eter); makanan; obat-obatan; kosmetik;
bahan peledak dan propelan (misalnya, nitroselulosa); dan juga sebagai perekat.
● SEC merupakan metode yang digunakan dalam karakterisasi dan analisis selulosa. Selulosa
adalah suatu homopolimer dari monomer D-anhidroglukopiranosa yang dihubungkan melalui
ikatan glikosidik β-(1 4 )
● Oligomer selulosa dan selulosa dengan DP (derajat polimerasi) 7-9 tidak larut dalam air dan
sebagian besar pelarut organik, oligomer dengan DP 15-20 larut dalam dimetilsulfoksida
(DMSO). Kelarutan yang rendah disebabkan oleh sifat kristal selulosa dan ukuran kristal yang
besar serta adanya ikatan hidrogen yang terdapat dalam kristalit selulosa.

● Dua metode umum yang dapat digunakan dalam mengatasi masalah kelarutan selulosa untuk
analisis SEC : (1) pembentukan derivat selulosa dan (2) pelarutan selulosa menggunakan
“pelarut selulosa.”
 Derivat Selulosa

● Monomer mengandung empat hidroksil, dan pada ujung pereduksi mengandung

gugus hemiasetal dan tiga hidroksil. Hidroksil ini dapat diubah menjadi berbagai
eter dan ester. Derivatif ini yang dapat meningkatkan kelarutan sehingga dapat
digunakan untuk melakukan analisis SEC dari turunan selulosa.
● Namun, reaksi derivatisasi lebih rumit daripada reaksi untuk zat sederhana,
secara umum, reagen memiliki akses yang lebih besar ke daerah parakristalin
(amorf) daripada ke daerah yang sangat kristal. Selain itu, reaktivitas hidroksil
dalam daerah kristal bervariasi, disebabkan oleh pola ikatan hidrogen dalam kisi
kristal. Dengan demikian, dua perhatian utama dalam menggunakan derivat
selulosa untuk analisis SEC, yaitu turunannya tidak terbentuk sempurna dan
substituennya tidak terdistribusi secara merata sepanjang panjang rantai
selulosa, selain itu kondisi reaksi yang digunakan untuk membentuk turunan
selulosa dapat menyebabkan degradasi molekul selulosa, misalnya dengan
hidrolisis ikatan glikosidik atau dengan oksidasi.
Pelarut Selulosa

● Pelarut yang biasa digunakan untuk analisis selulosa

menggunakan SEC yaitu :
● THF (Tetrahidrofuran),
● Diklormetan,
● DMSO,
● Dimethylformamide,
● Pyridin,
● Cadoxen, dan
● Dimethylacetamide (DMAc)/LiCl
 SEC Derivat Lignin

● Di antara biopolimer, lignin menempati urutan kedua setelah

selulosa dalam hal kelimpahan. Lignin dibentuk oleh
dehidrogenatif yang dikatalisis oleh enzim polimerisasi monolignol
yang berbeda pada substituen metoksil di sekitar cincin aromatik.
Ada tiga prekursor berikut, p-hidroksisinamil (p-kumaril) alkohol, 4-
hidroksi-3- alkohol metoksisinamil (koniferil), dan alkohol 4-
hidroksi-3,5-dimetoksisinamil (sinapil); dapat digabungkan secara
oksidatif membentuk hubungan antar unit yang berbeda ketika
digabungkan menjadi struktur makromolekul lignin.
● Hal paling mendasari preparasi lignin yang diisolasi yaitu distribusi berat molekulnya. SEC
yang digunakan untuk menentukan distribusi berat molekul lignin harus berada di bawah
interaksi zat terlarut dengan zat terlarut (asosiasi), zat terlarut dengan pelarut (solvasi), dan zat
terlarut dengan bahan pengemas kolom (adsorpsi) yang diminimalkan. Kalibrasi berat molekul
absolut dari elusi kromatografi eksklusi ukuran sangat penting untuk penentuan distribusi
berat molekul lignin terisolasi.
● Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak harus memiliki kelarutan sedang hingga tinggi
untuk preparasi lignin, dan pada saat yang sama mereka harus kompatibel dengan kinerja
kolom yang optimal. Namun demikian, dioksan dan tetrahidrofuran (THF), biasanya
memberikan kelarutan pada spesies dengan berat molekul yang lebih tinggi pada sampel
lignin. Sebaliknya, dimetilformamida (DMF) dan dimetilsulfoksida (DMSO), di mana sebagian
besar preparat lignin jauh lebih larut.
 Kromatografi eksklusi ukuran pada pati

● Pati merupakan salah satu pilisakarida yang melimpah di Alam.

Setiap bagian pada organ tumbuhan tingkat tinggi mengandung
pati. Granul pati dapat ditemukan pada pollen, daun, batang,
jaringan kayu, akar, umbi, bunga, buah dan biji.
● Kegunaan dari pati juga beraneka ragam. Pada industri makanan
pati digunakan untuk meningkatkan adesifitas, pengikat, pelembab,
pembentuk gel dan pengeras. Selain itu, digunakan juga untuk
pelicir dan penstabil. Pati dapat menjadi sumber terbarukan dan
bersifat biodegredable
 Struktur Pati

● Pati adalah polimer dari a-D-glukopiranosa.

● Pati dapat dengan mudah diekstraksi dari biji, batang, atau
akar tanaman utama.
● Pati asli biasanya terdiri dari dua komponen. Salah satu
komponen, yang disebut amilosa, adalah polimer linier (1,4
ikatan) atau bercabang ringan (ikatan 1,6). Komponen lain,
yang disebut amilopektin, sangat bercabang.
● Rasio amilosa dan amilopektin dalam pati asli tergantung
pada jenis tanaman. Pati dari waxy corn atau waxy rice pada
dasarnya adalah 100% amilopektin.
● Berat molekul amilosa bervariasi dari beberapa ratus ribu
hingga beberapa juta. Untuk amilopektin bisa lebih dari
beberapa ratus juta.
 SEC Pati

● Sebagian besar sistem SEC awal menggunakan air, larutan natrium

hidroksida, atau buffer sebagai fase gerak.
● Bahan kemasan yang paling sering digunakan adalah Sephadex,
Sepharose, atau BioGels.
● Dimetilsulfoksida (DMSO) dikenal sebagai pelarut yang baik untuk
pati. Pada tahun 1974, Dintzis dan Tobin menentukan berat
molekul amilosa dengan menggunakan campuran 95% DMSO dan
5% air sebagai fase gerak pada kolom kaca berpori.
● Sejak itu, DMSO atau DMSO murni yang mengandung fase gerak
telah digunakan pada berbagai jenis kemasan. Pati dalam larutan
DMSO sangat stabil. Autosampler dapat digunakan dalam sistem
DMSO SEC.
Pengaruh garam
KCl dalam fase
gerak berbasis air
 Pengaruh suhu penyuntikan
terhadap profil elusi sampel
pati jagung
Grafik menunjukkan profil elusi sampel pati
jagung yang dianalisis dengan Waters ALC/GPC-
150C. Hasilnya menunjukkan bahwa beberapa
molekul pati dapat mengendap di bagian bawah
botol sampel ketika larutan sampel disimpan
pada suhu kamar.
 SEC pada asam nukleat

● Pada tahun 1979, asam nukleat berhasil dipisahkan dengan

menggunakan SEC kinerja tinggi. Sejak saat itu, SEC menjadi salah
satu metode yang efektif untuk memisahkan berbagai jenis asam
nukleat menurut ukuran molekulnya.
● Sejak itu, pemisahan RNA yang berhasil, fragmen DNA, plasmid,
dan oligonukleotida telah dilaporkan.
● SEC pada asam nukleat bergantung pada nilai dari bobot molekul
RNA, DNA, Plasmid atau oligonukleotida yang ingin dipisahkan.
 Kolom SEC Asam Nukleat

● Dua jenis kolom telah digunakan dalam SEC asam nukleat

● Kolom silika berpori yang terikat secara kimia
● Kolom resin hidrofilik.
● Diantaranya, kolom TSKgel SW dan PW telah diterima dengan baik.
● Namun, resolusi tergantung pada kolom yang digunakan. Oleh
karena itu, sangat penting untuk memilih kolom terbaik tergantung
pada berat molekul sampel yang akan dipisahkan
Kolom yang dapat digunakan untuk pemisahan berdasarkan
bobot molekul
 Fase Gerak pada SEC Asam Nukleat

● Pada umumnya fase gerak yang digunakan untuk SEC asam nukleat
adalah buffer dan garam. Hal ini karena Asam Nukleat hanya stabil
pada pH dan kondisi tertentu.
Hubungan HETP dan
Laju Alir
● Pada Grafik menunjukkan adanya
hubungan antara HETP (Height Equivalent
Theoretical Plate) dengan laju alir pada
SEC Fragmen RNA dan DNA. HETP akan
menurun dengan menurunnya laju aliran.
● Khususnya dengan sampel dengan berat
molekul tinggi, seperti 16S rRNA dan
fragmen DNA dari 383 pasangan basa.
HETP mencapai minimum pada laju aliran
yang lebih rendah dari 0,1 ml/menit.
● Laju aliran 0,3-0,5 ml/menit merupakan
pilihan yang baik ketika waktu pemisahan
dan resolusi dipertimbangkan.
 Daftar Pustaka

● Striegel, AM. 2017. Liquid Chromatography 2nd Fundamental

and Instrumen. United State: Elsevier. p. 245-273.
● Giridhar, et al. 2017. Thermal and Rheological Measurement
Techniques for Nanomaterials Characterization. India: Elsevier.
p. 51-65.
● Wu, CS. 1995. Handbook of size exclusion chromatography.
New York: Marcel Dekker Inc.