1

PERCOBAAN IV

Judul : Pemisahan Pigmen dari Tanaman
Tujuan : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai
1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan.
2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar.
3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan menggunakan KLT
dan kromatografi kolom
Hari/tanggal : Selasa / 5 April 2011
Tempat : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

1. DASAR TEORI
1.1 Daun dan Pigmen Tanaman
Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya
berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari
melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa
tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan
berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun
berasal dari kandungan klorofil pada daun.
Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara
lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil
mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non
polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar
seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b,
yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur


2

klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan
klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C
40
H
56
adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan
rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha
karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi
mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-
karoten dan -karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan
rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.



3


Gambar 3. Struktur -karoten


Gambar 4. Struktur -karoten
Xantofil C
40
H
50
O
2
adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil
dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam
alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki
struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada
struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru
atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun,
terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai
halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan
kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum
dari antosianin adalah sebagai berikut.


4


Gambar 6. Struktur umum antosianin
1.2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-
komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase, yakni
fase diam dan fase gerak. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi
dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi).
Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi
kolom, kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Pemisahan berdasarkan
kromatografi adsorpsi, sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan
padat.
Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan, dapat dilakukan dengan kromatografi
kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat
atau cair). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan
bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan dicapai oleh
perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh
kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer).
Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya.
Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom
yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan
teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat
dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses
pemisahan yang lebih optimal.
Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada
permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar.


5

Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar, maka pada saat campuran
dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa
stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar
kolom lebih cepat.
Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat
dibedakan menjadi dua, yaitu :
1. Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat
polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.
2. Kromatografi fase terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase
geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus
senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa
retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang
senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom)
dalam kolom.
Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas, plastik atau
nilon. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan
panjang 45 cm. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir
eluen. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass
wool) atau gelas berpori (fritted glass). Sorben yang digunakan dalam kromatografi
kolom diantaranya arang, magnesium silikat, alumina, silika gel, kalsium sulfat dan
serbuk selulosa. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana, alkena,
aromatis, eter, ester, keton, aldehid dan alkohol.



6

Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom :

Gambar 7. Bagan kolom kromatografi


Gambar 8. Kolom berisi sampel


7


Gambar 9. Proses pemisahan pigmen tanaman

Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara
kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi
kolom berhasil atau tidak. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya
adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatome, selulosa dan lainnya yang mempunyai
ukuran butir sangat kecil yaitu 0,063 0,125 mm dilapiskan pada kaca, lembaran
aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu.
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang
fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau
karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending).
Pada prakteknya, sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam
chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat
yang telah dibuat sebelumnya, plat diangkat dan dikeringkan. Setelah daerah dari noda
yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa.


8

Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda
relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan
parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan
migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan
besaran yang karakteristik dan reprodusibel.
Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT).


Gambar 10. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT)



Gambar 11. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT



9


Gambar 12. Perbandingan untuk perhitungan Rf

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah
dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan.
Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat
dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.
Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

1.3 Beberapa Jenis Tumbuhan
1. Daun Puring (Codiaeum variegatum)
Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan
populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang
sangat bervariasi. Beragam kultival telah dikembangkan dengan
variasi warna hijau, kuning, jingga, merah, ungu, serta
campurannya. Bentuk daunnya bermacam-macam, memanjang,
oval, tapi bergelombang helainya terputus-putus dan


10

sebagainya.
Secara botani, puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Ciri yang
sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket, yang
merupakan ciri khas suku Euphobaceae.
2. Daun sirih hijau (Piper crocatum)
Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam
family piperaceae, yang tumbuh merambat dengan bentuk
daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh
berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun
yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Dalam
daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni
alkaloid, saponin, tannin dan flavonoid. Sirih hijau sejak
dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai
jenis penyakit. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar, maupun
ekstrak kapsul. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit,
seperti diabetes, hepatitis, batu ginjal dan sebagainya. Daun sirih hijau berasa pahit dan
getir, namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau.
Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan, namun masih juga
mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. Warna hijau pada daun
berasal dari kandungan klorofil. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam
menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis.
Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten, xantofil dan antosianin.
3. Daun seledri (Apium graveolens)
Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang
biasa digunakan sebagai bumbu masakan. Beberapa negara
termasuk Jepang, Cina dan Korea mempergunakan bagian
tangkai daun sebagai bahan makanan. Di Indonesia
tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan
digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai
lalapan. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa:


11

daun, tangkai daun, buah, dan umbinya semua dimanfaatkan. Kandungan utamanya
adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. Terdapat juga
sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0,1 - 0,7%), serta senyawa
golongan fenol. Komponen lainnya apiin, isokuersitrin, furanokumarin, serta
isoimperatorin. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). Daun
dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol.
4. Daun kemangi (Ocimum sanctum)
Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang
paling rendah. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan
tanaman semusim, daun berukuran kecil dengan helaian
daun yang tipis. Selain itu, daun kemangi hanya tersusun dari
selapis jaringan palisade, mesofil. Khususnya jaringan
palisade yang mengandung klorofil. Umur daun, morfologi
daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor
yang menentukan kandungan klorofil.
5. Daun katuk (Sauropus androgynus)
Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar
kalsium yang tinggi. Kandungan vitamin C pada daun katuk
jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. Terdapat
tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi
hormon-hormon steroid (seperti progesteron, estradiol,
terstosteron, glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid
(diantaranya prostaglandin, prostasiklin, tromboksan,
lipoksin dan leukotrien).
Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu
pengeringan, kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. Daun
katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Daun ini kaya akan
vitamin K, selain itu pro-vitamin A ( -karoten), B dan C. Mineral yang dikandungnya
adalah kalsium (hingga 2,8 %), besi, kalium, fosfor dan magnesium.
6. Daun singkong (Manihot utilisima L)


12

Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan
klorofil b yang tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa
kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi
cahaya lebih efisien, sehingga laju fotosintesisnya juga lebih
tinggi. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses
fotosintesis. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik
yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat
reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi cahaya akan diubah menjadi energi
kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam
fotosintesis.
7. Daun kangkung (Ipomoea aquatica)
Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif
rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Hal ini diduga
klorofil pada tanaman kangkung tersebar, tidak hanya
pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian
batang. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung
lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi
cahaya.
8. Daun bayam (Amaranthus spp)
Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi
daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun
sitokrom, protein yang terlibat dalam proses fotosintesis)
sehingga berguna bagi penderita anemia. Daun bayam
mempunyai kandungan klorofil yang tinggi, sehingga laju
fotosintesisnya juga tinggi.
9. Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb)
Daun pandan mengandung klorofil yang sangat
tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami.
Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat


13

laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.


II. ALAT DAN BAHAN
2.1 Alat yang digunakan
1. Kolom kaca : 9 buah
2. Gelas ukur 10 ml : 9 buah
3. Corong biasa : 9 buah
4. Batang pengaduk : 9 buah
5. Gelas kimia 250 ml : 9 buah
6. Tabung reaksi : 36 buah
7. Rak tabung reaksi : 9 buah
8. Pipet tetes : 9 buah
9. Lumpang dan alu : 9 buah
10. Statif dan klem : 9 buah
11. Cawan porselin : 9 buah
12. Bunsen + kaki tiga + kain kasa : 9 buah

2.2 Bahan yang digunakan
1. Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung,
bayam, dan pandan.
2. Etanol
3. Glass wool


14

4. Sebuk Al
2
O
3

( alumina )
5. Kertas saring
6. Petroleum eter
7. Kloroform
8. Metanol

III. PROSEDUR KERJA
3.1 Ekstraksi Sampel
1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.
2. Menambahkan 20 mL etanol, mengaduk sampai merata.
3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong.
4. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan
tinggal setengah mL.

3.2 Pembuatan Kromatografi Kolom
1. Menyiapkan kolom gelas 50 mL, tinggi 20 cm dan diameternya 1,5 cm yang
bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran.
2. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.
3. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.
4. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al
2
O
3
) dengan 25 mL etanol.
5. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil
mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka, serta secara sedikit demi
sedikit (jangan ada gelembung udara).
6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina
dalam kolom dan memasukkan glass woll.


15


3.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan
1. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut
etanol turun mendekati penyerap (adonan Al
2
O
3
).
2. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan
kepolarannya yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Jika
permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap.
3. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi
yang bersih.
4. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom
kaca.

IV. HASIL PENGAMATAN
No. Perlakuan Hasil Pengamatan
1.

2.

3.

4.
5.


6.
Menggerus sampel daun + 20 ml
etanol
Menyaring campuran

Memasukkan glass wool dalam
kolom + 1 ml etanol
Al
2
O
3
+ 25 ml etanol
Memasukkan adonan alumina +
glass wool kedalam kolom + 2 ml
etanol +larutan sampel
Mendiamkan sampai larutan
sampel menetes
Menambahkan petroleum eter
Campuran

Filtrat: larutan hijau tua
Residu: ampas daun
Tinggi glass wool 1 cm

Glass wool dan etanol dalam kolom
Adonan alumina, campuran





16


7.

8.















Sampel yang digunakan:
A. Daun singkong:
1. Tabung I + petroleum eter
2. Tabung II + Kloroform
3. Tabung III + Etanol
4. Tabung IV + metanol

B. Daun Pandan:
5. Tabung I + petroleum eter
6. Tabung II + Kloroform
7. Tabung III + Etanol
8. Tabung IV + metanol

C. Daun Bayam:
9. Tabung I + petroleum eter
10. Tabung II + Kloroform
11. Tabung III + Etanol
12. Tabung IV + metanol


D. Daun Kemangi:
13. Tabung I + petroleum eter
14. Tabung II + Kloroform

Larutan sampel menyebar dan
menetes


1. larutan hijau muda
2. larutan hijau tua
3. larutan hijau kekuningan
4. larutan kuning


5. larutan hijau muda
6. larutan hijau tua
7. larutan hijau kekuningan
8. larutan hijau muda


9. larutan hijau muda
10. larutan hijau tua
11. larutan hijau tua
12. larutan hijau tua


13. larutan hijau bening
14. larutan hijau kekuningan


17

15. Tabung III + Etanol
16. Tabung IV + metanol

E. Daun Puring:
17. Tabung I + petroleum eter
18. Tabung II + Kloroform
19. Tabung III + Etanol
20. Tabung IV + metanol

F. Daun Kangkung:
21. Tabung I + petroleum eter
22. Tabung II + Kloroform
23. Tabung III + Etanol
24. Tabung IV + metanol

G. Daun Sirih:
25. Tabung I + petroleum eter
26. Tabung II + Kloroform
27. Tabung III + Etanol
28. Tabung IV + metanol

H. Daun Katuk:
29. Tabung I + petroleum eter
30. Tabung II + Kloroform
15. larutan hijau kekuningan
16. larutan kuning


17. larutan kuning jernih
18. larutan hijau muda
19. larutan hijau muda
20. larutan hijau muda


21. larutan hijau tua
22. larutan hijau muda
23. larutan hijau kekuningan
24. larutan hijau bening


25. larutan kuning bening
26. larutan kuning tua
27. larutan kuning
28. larutan kuning


29. larutan hijau muda
30. larutan hijau muda


18

31. Tabung III + Etanol
32. Tabung IV + metanol

I. Daun Seledri:
33. Tabung I + petroleum eter
34. Tabung II + Kloroform
35. Tabung III + Etanol
36. Tabung IV + metanol
31. larutan hijau tua
32. larutan hijau tua


33. larutan hijau muda
34. larutan hijau tua
35. larutan hijau muda
36. larutan hijau tua


V. ANALISIS DATA
Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun,
yaitu daun Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan
pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum
eter, kloroform, metanol, dan etanol. Setelah itu menguji masing-masing ekstrak pelarut
dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen
yang terkandung dalam daun tersebut.

5.1 Ekstraksi Sampel Daun
Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu, lalu
mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Penumbukan ini bertujuan
menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam
pelarut etanol, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi
kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak. Etanol efektif
untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti
klorofil, karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat
larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. Namun proses ekstrasi ini harus


19

dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar
akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam
daun akan berkurang. Reaksinya adalah sebagai berikut.
Etanol + klorofil fitol + etil klorofilida
Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung
pigmen tanaman, sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini,
selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula.



20

5.2 Penyiapan Kolom Kromatografi
Selanjutnya membuat kolom kromatografi, dimana langkah pertama yang
dilakukan adalah membuat adonan Al
2
O
3
dengan pelarut etanol sehingga terbentuk
bubur alumina. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-
OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan
alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. Bubur
alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak
terbentuk gelembung udara, kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada
gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga
akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT.
Dalam hal ini alumina Al
2
O
3
yang digunakan sebagai adsorben atau fase
diamnya, karena Al
2
O
3
lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu,
sebelum dimasukkan alumina, bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll, hal ini
bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom
karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan
alumina, tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir.
Saat mengisi kolom, kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga
diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass
woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring.
Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai,
kran kolom ditutup.
5.3 Pemisahan Pigmen Tanaman
Setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun di masukkan ke
dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Di sini
terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes.
Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti
tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. Larutan berawarna ini
adalah pigmen dari daun sampel. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan
kepolaran yang paling kecil yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Pelarut
ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan.


21

Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Kita misalkan di
dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil, ketika petroleum eter kita masukkan ke
dalam kolom, klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan
yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama, berarti
klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Ini dapat terjadi karena alumina
adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar.
Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil, akan keluar dari
kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat
dari pada klorofil. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar
dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom
dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula
seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang
lebih polar seperti xantofil.
Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah :



Gambar struktur klorofil a
Gambar struktur klorofil b


22

























Gambar struktur -karoten
Gambar struktur -karoten
zzz
Gambar struktur antosianin


23


Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari
kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil,
karoten, baru kemudian xantofil. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam
pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung, apakah dalam petroleum eter,
kloroform, etanol atau metanol.
1. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I dengan
pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. Sedangkan pada
tabung lainnya dengan pelarut kloroform, etanol dan metanol menghasilkan larutan
berwarna hijau muda. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun
seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau
dengan semua pelarut.
Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter
yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari
strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara
keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri
mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna
hijau muda).
2. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan
pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak dilakukan maka
analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang
dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga
dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil.
Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten
karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak
rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan


24

(warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten
memang senyawa yang berwarna kuning.
Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung
xantofil (C
40
H
50
O
2
) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan
dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini
sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna
kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat
larut dalam etanol yang juga bersifat polar.
3. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I dengan
pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Pada tabung II dengan
pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Tabung III dengan pelarut
etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut
metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau. Warna hijau yang dihasilkan
menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil
merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut.
Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter
yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari
strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara
keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri
mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna
hijau muda).
4. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong
Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Untuk pelarut
petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen
klorofil b (C
55
H
70
O
6
N
4
Mg). Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua
menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C
55
H
72
O
6
N
4
Mg). Klorofil merupakan senyawa
yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter
maupun kloroform. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan
menunjukkan adanya pigmen karoten. Meskipun karoten bersifat nonpolar, tetapi


25

kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. Untuk pelarut metanol
menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil.
Untuk uji KLT, harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut
lebih larut dalam eluennya. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil, artinya
komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Karena pelarut yang digunakan
adalah etanol yang bersifat polar, maka bila harga Rf kecil, larutan tersebut memiliki
komponen yang bersifat nonpolar, dan sebaliknya apabila harga Rf besar, komponen
yang terkandung bersifat lebih polar. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui
bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten
terhadap etanol. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil
a terhadap kloroform, dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil.
5. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam
Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya.
Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. Namun
pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil, dimana seharusnya
untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol
menghasilkan pigmen xantofil. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter
dan etanol.
6. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan
pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak dilakukan maka
analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang
dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga
dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil.
Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten
karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak
rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan
(warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten
memang senyawa yang berwarna kuning.


26

Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung
xantofil (C
40
H
50
O
2
) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan
dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini
sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna
kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat
larut dalam etanol yang juga bersifat polar.
7. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan
Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan, untuk fraksi yang larut di
dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan
kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform
diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat
non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Untuk fraksi yang larut bersama etanol
dan metanol diduga mengandung xantofil (C
40
H
50
O
2
) karena pigmen xantofil lebih larut
dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini
berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang
merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen
yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar.
8. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau
Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur
yang ada, ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan
noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna
yang paling muda sampai tua.
Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah
klotofil, xantofil dan karoten. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar, namun
karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada
klorofil. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter, sedangkan karoten
keluar bersama dengan pelarut kloroform. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam
alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol.
9. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung


27

Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. Pada tabung I dan II
dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih
tua. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau
muda. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna
hijau kekuningan. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun
kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau.
Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten
merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan.
Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya
adalah senyawa nonpolar. Oleh karena itu, klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum
eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Sesuai dengan literatur di mana daun
kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan
berwarna hijau muda). Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam
etanol.




28

Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun
untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut :
No.
Sampel
Daun
Petroleum
eter
Kloroform Etanol Metanol
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Singkong
Pandan
Bayam
Kemangi
Puring
Kangkung
Sirih
Katuk
Seledri
Klorofil
Klorofil
Klorofil
Klorofil
Xantofil
Klorofil
Xantofil
Klorofil
Klorofil
Klorofil
Klorofil
Klorofil
Karoten
Klorofil
Klorofil
Xantofil
Klorofil
Klorofil
Karoten
Karoten
Klorofil
Karoten
Klorofil
Karoten
Xantofil
Klorofil
Klorofil
Xantofil
Klorofil
Klorofil
Xantofil
Klorofil
Klorofil
Xantofil
Klorofil
Klorofil

Untuk uji KLT, menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing
komponen adalah sebagai berikut :
1. Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil; Rf = 0,75
2. Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten; Rf = 0,756
3. Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767
4. Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767

VI. KESIMPULAN
1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman
dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk
melarutkan pigmen sampel daun.


29

2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina
dan fase gerak yaitu petroleum eter, kloroform, metanol dan etanol.
3. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun
masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan
adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.
4. Berdasarkan percobaan, daun singkong dan kemangi mengandung pigmen
klorofil, karoten, xantofil. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen
klorofil dan karoten. Daun bayam, katuk dan seledri mengandung pigmen
klorofil. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. Daun sirih
mengandung pigmen xantofil.

VII. DAFTAR PUSTAKA
Anwar, Chairil, Bambang Purwono, harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih.
1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta : Depdikbud.

Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis
Modern. Bandung : Remaja Rosdakarya.

Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB.

Tim Dosen Kimia Organik. 2010. Panduan Praktikum Kimia Organik II. FKIP Banjarmasin :
UNLAM. (Tidak dipublikasikan).






30








VIII. LAMPIRAN
8.1 Pertanyaan dan Jawaban
1. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam
kolom ?
2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan
mengapa terjadi demikian ?
3. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang
diinginkan ?
Jawaban
1. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena
dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap),
sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). Akibatnya terjadi
penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT.
2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Hal ini
dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum
benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul dengan fraksi
kloroform dengan pigmen karoten, dimana karoten dan kloroform sama-sama
nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen.
Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi


31

metanol yang membawa pigmen xantofil, fraksi ini muncul terakhir karena pigmen
ini lebih larut dalam alkohol.
3. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan
karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu
karoten, xantofil dan klorofil. Namun proses pemisahannya kurang sempurna, hal ini
mungkin dikarenakan:
1. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam.
2. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu
tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.
3. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan
waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan
warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki
keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang
tercampur.


32

8.2 Flow Chart
1. Ekstraksi Sampel



















10-15 lembar daun contoh*

Filtrat
Campuran
Residu
Lumatan daun contoh + etanol
Pelarut
- Melumatkan dalam lumpang
- Menambahkan beberapa mL etanol
- Mengaduk sampai merata
- Menyaring melalui corong biasa dengan kertas
saring
- Memekatkan dengan alat rotavapor sampai
cairan tinggal beberapa mL


33




N/B: * Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung,
bayam, dan pandan





B. Pembuatan Kromatografi Kolom











Larutan pekat
Glass wool
Glass wool + Etanol
Campuran I
- Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm,
hingga setinggi 1 cm
- Menuangkannya melalui corong dan
memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10
cm


34




















C. Pemisahan Pigmen dari Tanaman

Al
2
O
3
+ etanol
Adonan alumina
- Membuat adonan
Campuran 1 + adonan
Campuran II
- Memasukkan adonan melalui corong ke dalam
kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetuk-
ngetuk dan keran dalam keadaan terbuka
Campuran II + etanol


35


























- Mengelusi kembali, kemudian menutup keran
Campuran III + glass wool
- Memasukkan
- Membuka keran
Campuran IV + etanol
- Membuka keran
- Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai
terjadi kira-kira 20 tetes per menit, sampai permukaan
pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al
2
O
3
)
Campuran V + larutan contoh
- Memasukkan setinggi 1 cm
Campuran VI + pelarut
- Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara
bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum
benzen, kloroform, etanol dan metanol), jika permukaan
sampel telah mendekati permukaan penyerap
- Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan
beberapa tabung reaksi yang bersih
- Memisahkan berdasarkan warnanya
- Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah
keluar dari kolom


36










NB :
1. Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol)
LAMPIRAN
FOTO FOTO PERCOBAAN


Larutan berwarna


37










Gambar 17. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun
puring pada KK
Gambar 19. Sampel ekstrak daun
puring mulai turun
pada KK
Gambar 20. Sampel ekstrak daun
andong pada KK


38