A.

Judul Percobaan
Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatography, TLC)

B. Tujuan Percobaan
Pemisahan asam-asam amino dalam suatu campuran dengan cara
kromatografi lapis tipis.
C. Landasan Teori
Kromatografi adalah teknik pemisahan dan pemurnian komponen dari
campurannya yang umum. Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan
suatu campuran yang berdasarkan kepada kesetimbangan fase, yaitu fase diam dan
fase bergerak. Fase diam merupakan lapisan cairan pelarut (pengembang) yang
teradsorpsi pada permukaan kertas, sedangkan fase bergerak merupakan bagian
pelarut (pengembang, eluen) yang berfungsi menggerakkan komponen. Teknik ini
didasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi senyawa saat diberi eluen tertentu.
Secara umum, ada beberapa macam teknik kromatografi, yaitu kromatografi
kertas (KK), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi
gas, dan kromatografi kinerja tinggi (KKT) (Pambudi, 2014: 181).
Kromatografi lapis tipis (KLT) sangat mirip dengan kromatografi kertas,
terutama pada cara melakukannya. Perbedaan nyata terliuhat pada mediah
pemisahannya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben halus yang tersangga pada
papan kaca, aluminium atau plastic sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis
adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam (Soebagio, 2003: 85).
Kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas (KKt) adalah
metode kromatografi cair yang paling sederhana. KLT dapat dapat dipakai dengan
dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil
kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem
pelarut dua sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau
kromatografi cair kinerja tinggi. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua peubah:
sifat fase diam atau sifat lapisan, dan sifat fase gerak atau campuran pelarut
pengembang. fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai
permukaan penjerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga
untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Hampis segala macam serbuk dapat
dan telahdipakai sebagai penjerap pada KLT. Empat penjerap paling umum yang
dipakai yaitu silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), giselgur (tanah
diatome) dan selulosa. Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau
campuran pelarut (Gritter, 1985: 107-109).
Metode kromatografi lapis tipis (KLT)-densitometri merupakan salah satu
metode yang diharapkan dapat digunakan untuk penentuan kadar kolkisin dalam
infus karena relatif sederhana , tidak mahal, dan bila menggunakan fase gerak
yang cocok akan dapat memisahkan kolkisin dari senyawa lain yang terdapat
dalam infus tersebut. Oleh karena itu dalam penelitian ini akan dilakukan validasi
metode KLT-densitometri untuk penentuan kadar kolkisin dalam infus daun
Gloriosa superba Linn (Hilmi, 2013: 2).
Kromatografi lapis tipis maupun kertas sedikit bahan di taruh pada daerah
terbatas di dekat ujung selembar kertas saring atau lapis tipis, dan suatu pelarut
atau lapis tipis, dan suatu pelarut dibiarkan berdifusi dari ujung kertas atau lapis
tipis oleh kerja kapiler; pada kondisi yang sesuai setelah beberapa waktu,
campuran akan dijumpai telah berpindah dari penotolan tadi dan telah terpisah
seluruhnya atau sebagian menjadi komponen-komponennya sebagai zona yang
jelas. Zona-zona dalam bentuk noda-noda atau pita-pita dapat ditentukan letaknya
dengan penggunaan reagensia kimiayang sesuai kepada kertas itu atau oleh
pendarah fluor nitra-violet. Difusi pelarut dan pemisahan yang dihasilkan menjadi
noda-noda atau pita-pita kadang-kadang diberi istilah pengembangan
kromatografi; istilah ini sedikti menyesatkan dan tak boleh dikelirukan bila
digunakan dalam arti tersebut di atas dengan proses identifikasi berikutnya dengan
mana zona-zona itu dibuat nampak jelas oleh pengolahan kertas atau lapis tipi situ
dengan berbagai reagensia (Svehla, 1985: 535).
Ninhidrin merupakan hidrat dari triketon siklik, dan bila bereaksi dengan
asam amino menghasilkan zat berwarna ungu. Ninhidrin merupakan suatu
oksidator sangat kuat yang dapat menyebabkan terjadinya dekarboksilasi oksidatif
asam -amino untuk menghasilkan CO2.NH3 dan suatu aldehid dengan satu
atom karbon kurang daripada asam amino induknya (Fauziyah, 2012: 14).
 KLT dapat digunakan untuk uji kualitatif senyawa baku dengan
menggunakan nilai Rf sebagai parameter. Dua senyawa atau lebih dapat dikatakan
identik apabila mempunyai nilai Rf yang sama pada kondisi KLT yang sama.
Berdasarkan hasil analisis noda atau bercak masing-masing sampel dengan 3 fase
gerak yang berbeda, dihasilkan nilai Rf yang bervariasi. Nilai Rf sampel 1, sampel
2 dan baku pembanding asam mefenamat baik pada fase gerak pertama (etil asetat
: metanol : ammonia), fase gerak kedua (kloroform : metanol) maupun pada fase
gerak ketiga (sikloheksan : kloroform : metanol : asam asetat glasial) tidak
terdapat kesamaan pada masing-masing fase gerak (Rusnaeni, 2016: 90).
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih
baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna. Harga-
harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga
standar. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh hanya berlaku
untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun
demikian daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan
penyerap dapat diperoleh (Sastrohamidjojo, 2007: 34-35).
Harga Rf cukup konstan asal semua variable dikendalikan baik-baik.
Namun dijumpai bahwa laju-laju relatif gerakan itu konstan meskipun kendali
kurang ketat, sehingga memungkinkan identifikasi suatu pita pada sepotong kertas
berdasarkan posisi relatif pita itu terhadap pita-pita yang diketahui. Lagi pula
dengan besarnya jumlah uji bercak yang tersedia untuk mendeteksi ion-ion
anorganik secara terpisah. Jika kemurnian pelarut, temperature dan penjenuhan
atmosfernya benar-benar dijaga, maka harga Rf dipengaruhi antara lain oleh
faktor-faktor berikut : (a) kehadiran ion lain, misalnya adanya klorida dalam
pemisahan yang dilakukan dengan larutan-larutan nitrat, (b) keasaman larutan
aslinya; ini dapat disebabkan oleh kebutuhan akan asam dalam pembentukan
kompleks yang dapat larut dalam pelarut organik, untuk mencegah hidrolisis
garam, (c) waktu melakukan percobaan untuk sepotong kertas; kadang-kadang
harga-harga Rf mengikat dengan bertambahnya waktu dan ini mungkin
berpadanan dengan berkurangnya laju gerak garis depan pelarut, (d) adanya
kation-kation lain dan konsentrasi mereka (Svehla, 1985: 536).
D. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Pipa kapiler, 5 buah
b. Gunting 1 buah
c. Penggaris 1 buah
d. Pensil 1 buah
e. Chamber 1 buah
f. Gelas piala 600 mL 1 buah
g. Gelas ukur 10 mL 1 buah
h. Gelas ukur 25 mL 1 buah
i. Pipet tetes 3 buah
j. Klem kayu 2 buah
k. Hot plet 1 buah
l. Lap kasar dan 1 buah
m. Lap halus 1 buah
n. Botol semprot 1 buah
2. Bahan
a. Plat KLT
b. Larutan Ninhidrin 0,3 % (C9H6O4)
c. Larutan pengelusi A (butanol (C4H9OH), asam asetat (CH3COOH), air (H2O)
= 40 : 10 : 10)
d. Larutan pengelusi B (propanol (C3H7OH), air (H2O) = 70 : 30)
e. Aquadest (H2O)
f. Tissu
g. Alanin (C3H7O2N)
h. Asam glutamat (C5H9O4N)
i. Histidin (C6H9O2N3)
j. Tyrosin (C9H11O3N)
k. Larutan asam amino (Campuran x)
E. Prosedur Kerja
1. Disiapkan asam-asam amino standar dan campuran x yang diindetifikasi.
2. Ditotolkan 2 tetes dari masing-masing asam amino pada dua buah plat KLT
yang berbeda dengan jarak 1 cm dari ujung bawah plat.
3. Dibiarkan beberapa saat hingga plat kering.
4. Diletakkan masing-masing plat dalam chamber yang berisi pengelusi A
(butanol:asam asetat:air = 40:10:10) dan pengelusi B (propanol:air = 70:30).
diusahankan agar spot idak tercelup pada pengelusi.
5. Dibiarkan plat dalam chamber hingga larutan pengelusi sampai pada garis
atas ( 5 cm dari penotolan).
6. Plat dalam chamber diambil dan dikeringkan.
7. Disemprotkan larutan ninhidrin pada plat dan dikeringkan.
8. Dimasukkan plat pada hot plet hingga timbul warna atau noda.
9. Diukur jarak noda dan dihitung nilai Rf-nya.
F. Hasil Pengamatan
Nama Asam Harga Rf
Komponen
Amino Pengelusi A Pengelusi B
Noda
Alanin 0,1250 0,6600
1
Noda
As. Glutamat 0,0625 0,7400
2
Standar
Noda
Histidin 0,0416 0,1400
3
Noda
Tirosin 0,3750 0,7300
4
Noda
Alanin 0,1250 0,6800
1
Campuran
Noda
Tirosin 0,3750 0,1000
2

G. Analisis Data
1. Menghitung harga Rf pada pengelusi A
a. Alanin
Dik : jarak noda = 0,6 cm
Jarak eluen = 4,8 cm
0,6
Penyelesaian : = 4,8 = 0,1250
b. Histidin
Dik : jarak noda = 0,2
 Jarak eluen = 4,8
0,2
Penyelesaian : = 4,8 = 0,0416
c. Asam Glutamat
Dik : jarak noda = 0,3 cm
Jarak eluen = 4,8 cm
0,3
Penyelesaian : = 4,8 = 0,0625
d. Tyrosin
Dik : jarak noda = 1,8 cm
Jarak eluen = 4,8 cm
1,8
Penyelesaian : = 4,8 = 0,3750
e. Campuran
Dik : jarak noda 1 = 0,6 cm
jarak noda 2 = 1,8 cm
Jarak eluen = 4,8 cm
0,6
Penyelesaian : 1 = 4,8 = 0,1250
1,8
2 = = 0,3750
4,8
2. Menghitung harga Rf untuk pengelusi B
a. Alanin
Dik : jarak noda = 3,3 cm
Jarak eluen = 5 cm
3,3
Penyelesaian : = = 0,6600
5
b. Histidin
Dik : jarak noda = 0,7 cm
Jarak eluen = 5 cm
0,7
Penyelesaian : = = 0,1400
5
c. Asam Glutamat
Dik : jarak noda = 3,7 cm
Jarak eluen = 5 cm
3,7
Penyelesain : = = 0,7400
5
d. Tyrosin
Dik : jarak noda = 0,65 cm
Jarak eluen = 5 cm
0,65
Penyelesaian : = = 0,7300
5
e. Campuran
Dik : jarak noda 1 = 0,5 cm
jarak noda 2 = 3,4 cm
 Jarak eluen = 5 cm
0,5
Penyelesaian : 1 = = 0,100
5
3,4
2 = = 0,6800
5
H. Pembahasan
Kromatografi adalah teknik pemisahan dan pemurnian komponen dari
campurannya yang umum. Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan
suatu campuran yang berdasarkan kepada kesetimbangan fase, yaitu fase diam dan
fase bergerak. Fase diam merupakan lapisan cairan pelarut (pengembang) yang
teradsorpsi pada permukaan kertas, sedangkan fase bergerak merupakan bagian
pelarut (pengembang, eluen) yang berfungsi menggerakkan komponen. Teknik ini
didasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi senyawa saat diberi eluen tertentu
(Pambudi, 2014: 181). Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang
mirip dengan kromatografi kertas, bedanya kertas digantikan lembaran kaca atau
plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silika gel,
selulosa dan materi lainnya (Soebagio, 2003: 59). Pada percobaan ini bertujuan
untuk memisahkan asam-asam amino dan menentukan asam amino yang terdapat
didalam campuran X dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. Fasa gerak
pada percobaan ini yaitu larutan pengelusi dan fasa diamnya berupa silica gel
yang melekat pada plat KLT. Digunakan dua larutan pengelusi yang bertujuan
untuk mengetahui komposisi perbandingan pelarut atau pengelusi yang sesuai
untuk pemisahan asam-asam amino. Larutan pengelusi A berupa butanol, asam
asetat, dan air sedangkan larutan pengelusi B yaitu propanol dan air. Prinsip dasar
dari kromatografi lapis tipis ini adalah memisahkan komponen-komponen
senyawa berdasarkan perbedaan adsorpi atau partisi olehfasa diam yang berupa
lapisan tipis dan fase gerak berupa eluen. Adapun prinsip kerjanya yaitu
penotolan, dan penampakan noda.
Percobaan dilakukan dengan memotong plat KLT yang ukurannya telah
disesuaikan dengan ukuran chamber. Plat diberi garis batas atas dan batas bawah.
Menggunakan penggaris di mana penggaris ini bertujuan untuk memberi batas
uluen untuk merambat sehingga mempermudah menentukan harga Rfnya. Batas
atas sebagai batas rambatan eluen sedangkan batas bawah sebagai tempat
penotolan sampel yang tidak tercelup kedalam eluen. Karena apabila totolan
sampel tercelup kedalam eluen maka tidak akan terjadi perambatan noda keatas
melainkan sampel akan larut bersama eluen. Garis batas atas dan batas bawah
dibuat dengan menggunakan pensil, karena komponen pensil adalah grafit dimana
grafit ini tidak larut dalam eluen. Plat kemudian ditotolkan dengan sampel larutan
asam amino. Penotolan diusahakan tidak terlalu banyak karena akan
mempengaruhi besar totolan dimana totolan yang terlalu besar tidak baik bagi
penampakan noda karena nodanya dapat melebar kesamping atau kebawah.
Penotolan ini menggunakan pipa kapiler agar penotolan yang dihasilkan tidak
terlalu melebar, karena diameter pipa kapiler cukup kecil yaitu sekitar 8-10 m.
Setelah plat ditotolkan dengan sampel, plat kemudian dimasukkan kedalam
chamber yang berisi eluen dengan tidak menyentuh dinding chamber karena dapat
mempengaruhi perambatan noda. Chamber harus ditutup agar kondisi dalam
chamber terjenuhkan oleh uap dari pelarut dan mencegah penguapan pelarut.
Kondisi dalam chamber harus terjenuhkan agar kecepatan merambat zat
bertambah. Proses pengembangan eluen dihentikan setelah eluen mencapai batas
atas plat, selanjutnya plat dikeluarkan dan dikeringkan. Tujuan dari pengeringan
ini agar terlihatnya noda yang merambat pada plat. Setelah kering, plat kemudian
disemprot dengan ninhidrin. Ninhidrin merupakan hidrat dari triketon siklik, dan
bila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu. Ninhidrin
yang berfungsi untuk menampakkan noda dari hasil elusi yang ditandai dengan
adanya warna ungu. Hasil yang diperoleh sesuai dengan teori bahwa reaksi asam
amino dengan ninhidrin menghasilkan zat berwarna ungu. Ninhidrin merupakan
suatu oksidator sangat kuat yang dapat menyebabkan terjadinya dekarboksilasi
oksidatif asam -amino untuk menghasilkan CO2.NH3 dan suatu aldehid dengan
satu atom karbon kurang daripada asam amino induknya (Fauziyah, 2012: 14).
Reaksi yang terjadi adalah:
1. Alanin + ninhidrin
O O
NH2 OH
OH
H3C COOH + 2 N
OH + HOC-CH2-CH3 + CO2 + 4 H2O

O O O
Ungu
2. Asam glutamate + ninhidrin
O O
OH
NH2
OH
HOOC CH2 CH2 CH COOH + 2 N + HOC-CH2-CH2 -CH2 COOH + CO2 + 4 H2O
OH
O O O
Ungu

3. Histidin + ninhidrin
O O N
H2N N OH
OH
+ 2 N + HOOC CH2CH2 + CO2 + 4 H2O
HOOC CH OH
N N
O O O H
H
Ungu

4. Tyrosin + ninhidrin
H2N O O
OH
OH
HOOC CH CH2 OH + 2 N + HOOC CH2CH2 OH+ CO2 + 4 H2O
OH
O O O
Ungu

Setelah itu, plat dipanaskan dengan hot plate untuk memperjelas noda.
Karena dengan pemanasan, asam-asam amino akan memutuskan ikatan
rangkapnya sehingga akan memancarkan gelombang dengan panjang tertentu
yang dapat dilihat oleh kasat mata berupa warna tertentu. Berdasarkan hasil
percobaan, harga Rf asam-asam amino untuk pengelusi A yaitu; alanin: 0,1250,
histidin: 0,0416, asam glutamat: 0,0625, dan tirosin: 0,3750. Sedangkan pada
pengelusi B yaitu; alanin: 0,6600, histidin: 0,1400, asam glutamat: 0,7400 dan
tirosin: 0,7300. Dari hasil ini, dapat diketahui bahwa rambat asam amino pada
pengelusi B lebih besar daripada pengelusi A. Sehingga dapat disimpulkan bahwa,
larutan pengelusi yang baik digunakan untuk pemisahan asam amino adalah
larutan pengelusi B yang terdiri dari propanol dan air. Harga Rf asam amino
tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi asam amino yang terdapat pada
campuran X. Harga Rf campuran pada pengelusi A adalah 0,1250 dan 0,3750
sedangkan pada pengelusi B adalah 0,6800 dan 0,1000. Dari kedua harga Rf ini
dapat diketahui bahwa campuran x adalah asam amino alanin dan tirosin karena
mempunyai Rf yang sama pada pengelusi A dan B. Factor-faktor yang
mempengaruhi nilai Rf adalah kepolaran suatu zat yang terkadung dan dalam
merambat suatu zat yang berdasarkan pelarut yang sesuai dengan sampel yang
digunakan sehingga dapat memepengaruhi nilai Rf yang dikasilakan.
I. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa kromatografi lapis
tipis dapat digunakan dalam pemisahan asam amino, berdasarkan hasil yang
didapat yaitu harga Rf asam-asam amino dari kedua harga Rf ini dapat diketahui
bahwa campuran x adalah asam amino alanin dan tirosin karena mempunyai Rf
yang sama pada pengelusi A dan B.
2. Saran
Diharapkan untuk praktikan selanjutnya untuk lebih teliti dan berhati-hati
dalam penotolan sampel (penotolan jangan terlalu besar) sehingga tidak
menyulitkan pada proses identifikasi. Serta jaga plat agar tidak menyentuh
dinding. Serta hati-hati dalam mengaringkan jangan sampai plat jatuh sehingga
dapat terkontaminasi.
 DAFTAR PUSTAKA

Fauziyah, Begum. 2012. Analisis Kualitatif Fenilalanin Secara Chromatogrphy

Kertas dan Chromatogrphy Lapis Tipis. Sainstis, Vol. 1. No. 2

Gritter, Roy. 1985. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB Bandung

Hilmi, Auliya, Sudjarwo, dan Asri Darmawati. 2013. Validasi Metode

Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri untuk Penetapan Kadar
Kolkisin dalam Infus Daun Kembang Sungsang (Gloriosa Superba
Linn). Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol. 2, No. 2

Pambudi, Arief, Syaefudin, Nita Noriko, Risa Swandari, dan Purwanty Rara
Azura. 2014. Identifikasi Bioaktif Golongan Flavonoid Tanaman
Anting-anting (Acalypha Indica L). Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri
Sains dan Teknologi, Vol. 2, No. 3

Rusnaeni, Desy Ilmawati Sinaga, dan Fitria Lanuru. 2016. Identifikasi Asam
Mefenamat dalam Jamu Rematik yang Beredar di Distrik Heram Kota
Jayapura, Papua. Pharmacy, Vol. 13, No. 01, ISSN 1693-3591

Sastrohamidjojo, Hardjono. 2007. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty

Soebagio, Endang Budiasih, Sodiq Ibnu, Hayuni Retno Widarti, dan Munzil.
2003. Kimia Analitik II. Malang: JICA.
 JAWABAN PERTANYAAN

1. Yang terjadi jika protein terhidrolisis oleh asam kuat yaitu akan menghasilkan
asam-asam amino penyusunnya.
2. Prinsip dasar KLT adalah untuk identifikasi kualitatif untuk analisis
kuantitatif dimana fasa diam adalah lapisa tipis adsorben yang halus di atas
suatu lempeng gelas atau aluminium (Soebagio, 2002: 87).
3. Asam amino yang diidentifikasi pada campuran X adalah alanin dan tirosin,