LAPORAN

KIMIA FARMASI ANALISIS I

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Praktikum Kimia Farmasi
Analisis I

Disusun oleh :
Kelompok 5 dan 6
Kelas 3C Farmasi
Fery Ariansyah 31117117
Nida Puspa Dewi 31117127
Oktaviani Ayu S 31117128
Pegi Patmawati 31117129
Puput Arista Dewi 31117130
Puput Liska A 31117131
Regita Karmindya H 31117132
Reja Fauzi 31117133
Rezza Nurlatifah 31117134
Rifki Pratama 31117135
Rika Rahmawati 31117136
Winni Wahyuni 31117150

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN

BAKTI TUNAS HUSADA TASIKMALAYA

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

2019
 Analisis Kualitatif Parasetamol Dengan Metode High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)

No. Praktikum : VIII

Hari/Tanggal : Senin, 18 November 2019
Sampel : Parasetamol

A. Tujuan
- Menganalisis preparasi sampel dalam sediaan farmasi
- Menganalisis dan mengidentifikasi sampel zat organik dalam sediaan farmasi
- Menetapkan mutu kemurnian pada bahan yang dipakai dalam sediaan farmasi
dengan metode HPLC
- Menentukan waktu retensi pada suatu senyawa

B. Dasar Teori
1. Pengertian HPLC
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatogarfi cair kinerja
tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi
karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi,
dan detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampu menganalisa berbagai
cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Depkes RI, 1995).
Mekanisme interaksi yang paling banyak dijumpai dilaboratorium adalah adsorbsi
dan partisi. Pada proses adsorbsi, molekul pelarut dan molekul zat terlarut menempati
permukaan zat padat pengadsorbsi (adsorbent). Dalam kromatografi partisi, fungsi zat
padat pengadsorbsi sebagai fasa diam digantikan oleh zat cair. Distribusi komponen
dalam fasa diam itu karena daya larutnya. Pada kromatografi cair, misalnya Kromatografi
cair Kinerja Tinggi (KCKT), molekul senyawa yang digunakan sebagai fasa diam
diikatkan secara kimia pada permukaan pertikel pendukung, menghasilkan kromatografi
fasa terikat. Berdasarkan perbandingan polaritas antara fasa diam dan fasa geraknya
dikenal kromatografi fasa normal bila fasa diam lebih polar dari fasa geraknya,
kromatografi fasa terbalik bila fasa gerak lebih polar daripada fasa diamnya. Karena fasa
diam yang digunakan tidak sebanyak pada kromatografi gas, maka selektifitas pemisahan
lebih mudah diperbaiki dengan merubah komposisi fasa gerak. (Sudaryo, 2001)
KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal
dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan
menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan
mengikuti jalannya reaksi sintetis (Rohman, 2006).
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan
itu antara lain; Mampu memisahkan molekul dari suatu campuran, kecepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang
dianalisis, resolusi yang baik, dapat digunakan bermacam-macam detector, dan kolom
dapat digunakan kembali. (Sudaryo, 2001).
2. Komponen HPLC

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus lebih besar
dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2
ml/menit.
Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus
mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1–10 ml/menit. Pompa ada
2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari
bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja
antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari
hasil yang menyimpang pada detektor.
 Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan
agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar
injektor, yaitu:
1. Hentikan aliran/stop flow Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
2. Septum Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang
digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai
60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3. Katup putaran (loop valve) tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari pada 10µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan
adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada
posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila
katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Ada 2 jenis kolom pada
KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom umumnya dibuat dari
stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga
digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan
kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode kromatografi cair kinerja
tinggi yang digunakan
Detektor pada KCKT dikelompokkkan menjadi 2 golongan yaitu:
1. Detektor universal: Mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa.
2. Detektor spesifik: Hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
detektor UV-Vis, detektofluoresensi dan elektrokimia (Rohman,2007).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur
yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi
ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991; Munson, 1991 dan
Rohman, 2007).
Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih
fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi)
2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak
yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi). puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai
kromatogram.
Ada beberapa parameter yang perlu diperhatikan dalam memperoleh kondisi
yang diinginkan dalam kromatografi antara lain :
1. Waktu Retensi. Waktu yang dibutuhkan suatu komponen untuk melewati suatu
kolom disebut waktu retensi yang dapat didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan
untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom, dihitung mulai
diinjeksikan hingga keluar kolom tepat pada saat konsentrasi maksimum.
2. Faktor Selektifitas. Suatu kolom dinyatakan baik apabila kolom tersebut cukup
selektif, dan dikatakan selektif apabila kolom tadi mampu menahan berbagai
komponen dengan kekuatan yang berbeda-beda.
3. Efisiensi Kolom Jumlah plat teoritik dalam suatu kolom sebanding dengan panjang
kolom. Karena itu jumlah plat teoritik suatu kolom dapat ditingkatkan dengan
memperpanjang kolom. Makin panjang kolom makin banyak jumlah plat teoritiknya
maka makin sempurna pemisahan.
4. Derajat pemisahan atau resolusi dari dua pita yang berdekatan didefinisikan
sebagai jarak antara puncak-puncak pita (atau pusat-pusat) dibagi dengan luas pita
rata-rata. Semakin tinggi harga N selalu memberikan resolusi yang membaik. Oleh
karena itu resolusi dapat diperbaiki dengan menambah panjang kolom. (Putra, 2003).
Parasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesik dan ant ipiretik yang
digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam.
Digunakan dalam sebagian besar resep obat analgesik salesma dan flu. Parasetamol
aman dalam dosis standar, tetapi karena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja
atau tidak sengaja sering terjadi dan tidak memiliki sifat antiradang.

Struktur Parasetamol
N- acetyl-para-aminophenol Berat molekul 151.17 Rumus empiris C8H9NO2.
 Parasetamol murni berbentuk Kristal padat yang meleleh pada suhu 167-171º. Daya
laut dalam air dingin adalah 1,43 g/ 100 cm3, tetapi jauh lebih larut dalam air panas
yakni 5 g/ 100 cm3 dan dalam etanol kelarutannya 14 g/ 100 cm3.

C. Prosedur Kerja
1. Penyiapa Eluen

Campurkan Metanol dengan Saring Menggunakan Nilon 0,4 Um (ket:

Air dengan Perbandingan 1 : 9 disarankan kalo air mengguakan0,2 Um
supaya bakteri tidak lolos )

2. Penyiapan Sample
 Buat Parasetamol 1000 PPM

Larutkan 100mg parasetamol

dengan 100ml

 Pengenceran

Parasetamol 1000 ppm di pipet 10
ml lalu di ad 25 ml ( jadi 400 PPM )
3. Proses Elusi
Lalu pipet hasil dari pembuatan tadi (400
PPM) 5 ml Lalu ad 25 ml ( jadi 80 ppm) lalu
disaring ( Nilon pori 0,45) (ket: disarankan
kalo air mengguakan 0,2 Um supaya
bakteri tidak lolos )

uM
SIapkan Vial lalu di bilas etanol ( Masukan Sample ( 80 PPM )
Pelarut PCT )Lalu bilas dengan kedalam Vial
sampel

Penjenuhan Fase Gerak Tempat Sample

Pastikan semua indicator ready Seting Posisi sampel pada software

Hasil = Waktu retensi dari sampel Mulai elusi

D. Hasil Pengamatan

Peak RetTime Type Width Area Heigth Heigth %

(min) (min) ( mAU*s) (mAU)
1 3.077 BB 0.1631 8059.41406 668.54633 99.4102
2 3.793 BB 0.1477 21.94986 2.20463 0.3278
3 4.542 BV 0.1687 20.49755 1.76173 0.2620
Total : 8101.86147 672.51269

E. Pembahasan

Pada praktikum kali ini tentang analisis kualitatif menggunakan HPlC atau yang sering
disebut dengan kromatografi cair kinerja tinggi yang bertujuan untuk menganalisis sampel
dengan menggunakan HPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi. Pada praktikum kali ini
menggunakan sampel paracetamol.

High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering disebut

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya
paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat
serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasi. Disamping itu, HPLC
juga digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu
retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012).

Parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah
Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (α), Efisiensi dan jumlah lempeng
teoritis (N). Prinsip dari metode ini pada umumnya sama dengan metode kromatografi, yaitu
didasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi solut yang dipengaruhi oleh perbedaan afinitas
solut terhadap fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007). Metode HPLC ideal
untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana, dan
kepekaannya tinggi (Munson, 1984).

Instrumen HPLC memiliki 2 jenis kolom berdasarkan jenis fase gerak dan fase diam
yang digunakan, yaitu kolom normal phase dan kolom reverse phase. Dalam praktikum ini
digunakan instrumen HPLC dengan jenis kolom reverse phase. Kolom reverse phase kolom
yang fase diamnya bersifat nonpolar sedangkan fase geraknya bersifat polar, kebalikan dari
fase normal. Fase diam nonpolar yang paling banyak digunakan adalah jenis C18, C8, dan C2
(Mulja dan Suharman, 1995).

Fase diam HPLC yang digunakan pada praktikum ini adalah C18. Penggunaan kolom
reverse phase karena parasetamol merupakan senyawa polar sehingga parasetamol mampu
dipisahkan oleh kolom reverse phase karena kolom reverse phase memiliki gugus oktadesil
silika (ODS atau C18) yang mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Selain itu, kolom C18 memiliki jumlah C yang banyak sehingga mengakibat sifat fase
diam ini cenderung bersifat non polar, akibatnya pemisahan terhadap parasetamol akan
semakin baik. Selain itu dengan kolom reverse phase, fase gerak yang digunakan bersifat
polar. Fase gerak yang digunakan pada kolom reverse phase HPLC adalah metanol-air
dengan perbandingan 90:10 yang memiliki drajat pro-analisis. Sehingga, dalam
penggunaannya pada metode HPLC harus disaring terlebih dahulu dengan pompa vakum
yang berisi membran filter untuk menyaring pengotor-pengotor bahkan yang berukuran
mikro dari fase gerak. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada
sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam
tabung yang sempit, sehingga dapat enyebabkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung
tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007). Pemilihan metanol-air sebagai fase gerak karena
metanol-air merupakan pelarut universal yang dapat mengelusi senyawa-senyawa yang
bersifat polar, hal ini disebabkan karena struktur dari metanol memiliki susunan unik dimana
gugus OH dan metil berdeketan menjadikkan metanol bersifat semipolar, sehingga bila
dipakai sebagai fase gerak, metanol mampu mengelusi senyawa baik yang polar maupun
nonpolar. Selain itu metanol memenuhi persyaratan sebagai fase gerak yaitu murni, tidak
terdapat kontaminan (karena metanol telah disaring sebelum digunakan), tidak bereaksi
dengan wadah ( packing), dapat melarutkan sampel, memiliki visikositas rendah, tidak
merusak sampel, dan seperti yang telah dibahan di atas salah satu syarat suatu fase gerak
adalah diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price). Air
merupakan pelarut universal yang bersifat polar, reasonable price. Sehingga dikombinasikan
dengan metanol untuk dapat memperoleh hasil pemisahan yang efisien.

Sebelum dilakukan proses analisis parasetamol dengan metode HPLC. Pertama-tama

dilakukan pengkondisian kolom. Pengkondisian kolom HPLC meliputi pengaturan tekanan
kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolom dengan menggunakan metanol-air. Proses
ini dilakukan untuk meningkatkan kepekaan kolom dan menghindari pengotor atau sisa analit
yang masih tertahan pada kolom pada analisis sebelumnya agar tidak mengganggu analisis
dan merusak kolom. Setelah dilakukan pengkondisian kolom.

Selanjutnya dilakukan analisis sampel. Fase gerak maupun larutan yang dianalisis
dialirkan dengan menggunakan sistem pompa. Pompa dibutuhkan untuk mengalirkan fase
gerak dengan tekanan sehingga dapat mengalir secara terus menerus melalui kolom secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Proses elusi dilakukan dengan cara
isokratik diamana elusi dengan menggunakan komposisi fase gerak yang sama tanpa ada
perubahan perbandingan fase gerak yang digunakan. Semua larutan sebelum dialirkan ke
sistem harus disaring terlebih dahulu dengan membran filter dengan tujuan yang sama seperti
saat menyaring fase gerak yaitu untuk menyaring pengotor-pengotor bahkan yang berukuran
mikro dari pelarut. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada
sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam
tabung yang sempit, sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung
tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007).

Injeksi larutan standar dan sampel ke dalam HPLC harus dilakukan dengan hati-hati
dan dijaga agar tidak ada gas yang terinjeksikan sebab adanya gas dapat menimbulkan
gelembung dan pengumpulan gas pada komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis. Detektor ini mampu memberikan kumpulan
kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses
(single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang
diinginkan dapat ditampilkan. Dengan detektor ini akan diperoleh spektrum UV tiap puncak
yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang
gelombang maksimal untuk sistem HPLC yang digunakan. (Gandjar dan Rohman, 2007).
 Setelah pengkondisian alat dilakukan pembuatan larutan parasetamol dengan
konsentrasi 80 ppm yang diambil 1 ml dari 400 ppm. Sebelum diinjeksikan, larutan
paracetamol disaring terlebih dahulu menggunakan syringe filter.

Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh data yang menunjukan larutan paracetamol

diperoleh nilai waktu retensinya yaitu pada peak pertama 3.077, peak kedua 3.793, dan pada
peak ketiga 4.542. waktu retensi pada peak pertama masih masuk kedalam rentang waktu
retensi paracetamol.