Atina Hussaana

Dept. Pharmacology & Therapy

Medical Faculty of UNISSULA
ALUR PENELITIAN BA /TO/OT
Bioassay in vitro Clinical
Bioassay in vivo assay

Preparasi Pembuatan
EKSTRAKSI
Bahan Simplisia

Identifikasi Identifikasi Fraksinasi

Kualitatif Kuantitatif Isolasi
GOLONGAN (Penetapan Pemurnian
Kadar)
Alkaloid Penentuan
Flavonoid Struktur
STANDARISASI kimia
Terpenoid
(senyawa marker)
Saponin
 SAMPEL
Identifikasi &
Ekstraksi
EKSTRAK

Pemeriksaan Ekstrak

EKSTRAK TERSTANDAR

UJI AKTIVITAS UJI EVEKTIVITAS UJI TOKSISTAS FORMULASI

PENDAHULUAN (ED-50) SUBKRONIS TABLET
UJI TOKSISITAS UJI TOKSISITAS Stabilitas
AKUT KHUSUS Aktivitas
SEDIAAN
TERPILIH
TEKNIK IDENTIFIKASI KUALITATIF

Fraksinasi + Pereaksi Pewarna Reaksi

Warna
GOLONGAN
APA?
Pereaksi Pewarna Bercak
(Semprot) Berwarna
Kromatografi
(KLT) +
Sinar UV Bercak
254 dan 366 nm Berpendar

Dibandingkan
warna / Rf SENYAWA
dengan bercak APA?
senyawa standar
 Identifikasi Fraksinasi + Pereaksi Pewarna
Kualitatif
GOLONGAN
Identifikasi Alkaloid : Metoda Culvenor-Fiztgerald
Alkaloid Kira-kira 4 gram sampel segar dirajang halus dan digerus dalam
lumpang dengan bantuan pasir, lalu ditambahkan kloroform
sedikit sampai membentuk pasta.
Tambahkan 10 ml larutan amoniak-kloroform 0.05 N dan digerus
lagi, saring campuran kedalam sebuah tabung reaksi kering.
Tambahkan 10 ml H2SO4 2 N dan kocok kuat. Diamkan larutan
sampai terbentuk dua lapisan.
Dengan menggunakan pipet yang telah diberi kapas pada
ujungnya untuk menyaring, ambil lapisan asam sulfat dan
masukan kedalam tabung reaksi kecil ( Lapisan kloroform
disimpan untuk pengujian terpenoid ).
Filtrat diuji dengan pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorf.
Terbentuknya endapan putih atau keruh dengan pereaksi Mayer.
Endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan orange
dengan pereaksi Dragendorf menunjukan sampel mengandung
alkaloid.
 Identifikasi Fraksinasi + Pereaksi Pewarna
Kualitatif
GOLONGAN
Flavonoid Identifikasi Flavonoid : Shinoda Test / sianidin Test

Kira-kira 0.5 mg sampel yang telah dirajang halus,

diekstrak dengan 5 ml metanol dan dipanaskan selama
5 menit dalam tabung reaksi. Ekstraknya ditambahkan
beberapa tetes HCl pekat dan sedikit serbuk
magnesium. Bila terjadi perubahan warna merah/pink
atau kuning menunjukan sampel mengandung
flavonoid.
 Identifikasi Fraksinasi + Pereaksi Pewarna
Kualitatif
GOLONGAN
Identifikasi Steroid / terpenoid : Metode Lieberman-
Terpenoid Burchard

Beberapa tetes kloroform pada uji

alkaloid, ditempatkan pada plat tetes. Tambahkan
anhidrida asetat 5 tets dan biarkan mengering.
Kemudian ditambahkan 3 tetes H2SO4 pekat. Timbulnya
warna merah jingga atau ungu menandakan uji positif
terhadap
 Identifikasi Fraksinasi + Pereaksi Pewarna
Kualitatif
GOLONGAN
Identifikasi Saponin : Uji Busa
Saponin
Uji saponin ini sebaiknya digunakan sampel yang
telah dikeringkan, karena test yang digunakan adalah
test pembentukan busa. Bila sampel yang basah
dididihkan dengan air suling, kemungkinan cairan sel
akan membentuk busa bila dikocok.
Caranya : sampel kering dirajang halus, dimasukan
kedalam tabung reaksi dan ditambahkan air suling,
didihkan selama 2-3 menit. Dinginkan, setelah dingin
dikocok dengan kuat. Adanya busa yang stabil selama
5 menit berarti sampel mengandung saponin.
Hasil skrining fitokimia dari ekstrak etanol
daun Eugenia malaccensis L.

Kandungan Kimia Pereaksi Hasil

Alkaloid Mayer +
Flavonoid Mg / HCl +
Terpenoid / steroid LB +
Fenolik FeCL3 +
Saponin Busa +
TEKNIK KROMATOGRAFI
Kromatografi
: suatu teknik pemisahan tertentu yang pada
dasarnya menggunakan 2 fase : fase tetap
(stationary) & fase bergerak (mobile).

Penggolongan sesuai dengan sifat-sifat dari

fase tetap, yang bisa berupa zat padat / zat
cair.

Jika fase tetap berupa zat padat disebut :

kromatografi serapan
Jika fase tetap berupa zat cair disebut :
kromatografi partisi.
Keuntungan kromatografi :

Merupakan metode pemisahan yang

cepat, mudah, murah & sederhana,
membutuhkan campuran cuplikan sedikit
sekali.

Dapat diulang.
Kromatografi Lapisan Tipis :
metoda pemisahan fisikokimia menggu-
nakan lapisan tipis yang dilekatkan pada
penyokong berupa plat dari gelas / logam.

Keunggulan : lebih peka (dapat memisahkan

bahan yang jumlahnya sedikitnya / ukuran g)

Deteksinya : dengan penyemprotan pereaksi

pewarna / lampu UV.

Biasanya untuk pemisahan senyawa larut lipid

(misalnya: lipid, steroid, karotenoid, kuinon )
Fase diam biasanya : silica gel
Fase gerak :
campuran pelarut organik dengan polaritas
rendah.

Penempatan cuplikan dengan pipa kapiler

/ mikropipet pada salah satu ujung plat KLT.

Kemudian plat KLT ditaruh dalam bejana

yang sudah ada dan dijenuhi dengan fase
gerak.
Deteksi hasil KLT :
Untuk senyawa tak berwarna pada
kromatogram dengan alat UV pendek
(254 nm) & atau panjang (365 nm).

Senyawa dengan 2 ikatan rangkap / lebih &

senyawa aromatik (benzena) punya serapan
kuat di 230 - 300 nm.

Deteksi dengan pereaksi pewarna semprot.

Menggunakan alat penyemprot khusus.

Metoda deteksi biologi untuk mendeteksi

senyawa kimia dengan aktivitas biologi
tertentu.
CONTOH KROMATOGRAM dengan pereaksi pewarna
1. Terpenoid :
1 2 3
Fraksi heksan dielusi dengan fasa gerak heksan:etil asetat (1 ml : 1 ml) didapatkan noda
berwarna merah ungu pada Rf 0,9 dan Rf 0,85 dengan penampak noda asam sulfat pekat
10 % dalam metanol.
2. Alkaloid :
Fraksi etil asetat dielusi dengan fasa gerak etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10)
didapatkan noda berwarna jingga pada Rf 0,83 dengan penampak noda dragendorf.
3. Flavonoid :
Fraksi etil asetat dielusi dengan fasa gerak kloroform : etil asetat ( 6 : 4 ) didapatkan noda
berwarna kuning pada Rf 0,1 dengan penampak noda citro borax.

Kromatogram terdepan tiap gambar adalah pengamatan di

bawah UV 254 nm
No. Parameter Hasil
1. Organoleptis Bentuk : Kental
Warna : Coklat tua
Bau : Khas
Rasa : Sepat
2. Kadar senyawa terlarut dalam :
Air 12,4% 0,551
Etanol 16% 0,924
3. Kadar abu 2,4% 1,03
5. Kadar abu yang tidak larut asam 0,1% 0,046
7. Total cemaran bakteri : 2,7 x 10 4 koloni/g (< 106)
8. Total cemaran kapang : 3,3 x 10 3 koloni/g (< 104)
9. Uji cemaran logam timbal {Pb} Negatif
10 Kandungan kimia ekstrak
Alkaloid +
Flavonoid +
Terpenoid +
Steroid +
Fenolik +
Saponin +
11. Profil KLT
Terpenoid (+) pada Rf 0,9 dan Rf 0,85
Alkaloid (+) pada Rf 0,83
Flavonoid (+) pada Rf 0,1
CONTOH KROMATOGRAM dengan deteksi UV

Gambar 32. Hasil KLT trans- dan cis-UCA

Larutan trans-UCA 4% dalam
DMSO dipapar radiasi UVB

a
selama 60 menit, akan
mengalami isomerasi, sebagian
berubah menjadi konformasi
cis. a. trans-UCA murni b. hasil

b
ekspose trans-UCA pada
radiasi UVB.

Cis-UCA Trans-UCA
Rf : 7/8.5 Rf : 4/8.5
= 0.82 = 0.47
Identifikasi & harga-harga Rf
Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal
Harga Rf = --------------------------------------------------------------------
Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

Jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui

Rx / Rstd = --------------------------------------------------------------------------
Jarak yang digerakkan oleh senyawa standart yang
diketahui
Faktor yang mempengaruhi gerakan noda
dalam KLT (mempengaruhi harga Rf) :
a. struktur kimia dari senyawa yang
sedang dipisahkan.
b. sifat penyerap dan derajat aktifitasnya
c. tebal dan kerataan lapisan penyerap
d. pelarut & derajat kemurnian fase
bergerak
e. derajat kejenuhan dari uap dalam
bejana
f. teknik percobaan
g. jumlah cuplikan yang digunakan
h. suhu
i. kesetimbangan
Pembuatan Kromatogram

Totolkan cuplikan dengan pipa kapiler, pada jarak 1

cm dari bagian bawah plat KLT.
(pada plat kecil noda berupa titik, pada plat besar
noda berupa deretan titik membentuk garis). Biarkan
beberapa saat hingga kering. Penotolan cuplikan
dapat diulang seperlunya, pada tempat yg sama.

Plat KLT dimasukkan dalam bejana yang berisi fase

gerak (noda jangan sampai tercelup )

Setelah fase bergerak naik sampai hampir ujung atas

plat, plat kemudian diambil dan dibiarkan kering.

Tentukan harga Rf.

May I thank you all, for being T
such an attentive audience
H
A
N
K

Y
O
T H A N K Y O U
25