ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM XANTIN OKSIDASE DARI

SUSU SAPI DAN UJI INHIBISI TERHADAP EKSTRAK ETANOL BIJI

AREN (Arenga pinnata Merr)

oleh
NURUL FAJRIAH K.
H311 15 320
Dibawah bimbingan :
Pembimbing Utama : Dr. Hasnah Natsir, M.Si
Pembimbing Pertama : Dr. Rugaiyah A. Arfah, M.Si
Departemen Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Hasanuddin
2019
LATAR BELAKANG

ASAM URAT

Xantin
Oksidase
 Nama Peneliti Judul Penelitian
Evans, dkk., 2005 Comparism of xanthine oxidase
activities in cow and goat milks
Kusuma, dkk., 2014 Uji Aktivitas Anti Hiperurisemia
Ekstrak n-Heksana, Etil Asetat,
dan Etanol 70% Biji Jinten
Hitam (Nigella sativa)
terhadap Mencit Hiperurisemia
Chang, dkk., 2018 New 7-oxoabietane-type
diterpenoids from the bark of
Cryptomeria japonica
and their xanthine oxidase
inhibitory activity
Hasil Penelitian
Karakterisatik enzim xantin oksidase dari
susu sapi memiliki kondisi optimum
(suhu 10 ⁰C; pH 7,5 dan konsentrasi
substrat 0,01 ppm) sedangkan pada susu
kambing optimum pada suhu 20 ⁰C, pH
7,2 -7,4 dan konsentrasi susbtrat 0,08
ppm
ekstrak etanol 70% biji jintan hitam dapat
menghambat aktivitas anti hiperurisemia
sebesar 37,24 ± 7,78 % dan ekstrak etil
asetat memiliki aktivitas sebesar 56,12 ±
19,49 %.
Turunan senyawa diterpenoid
18-hydroxysugiol and 1β-
hydroxysugiol
dapat menghambat aktivitas enzim xantin
oksidase sebesar 11.9% dan 21.7%
 RUMUSAN MASALAH
1. bagaimana cara mengisolasi enzim
xantin oksidase dari susu sapi?
2. bagaimana karakteristik enzim xantin
oksidase dari susu sapi?
3. apakah ekstrak etanol biji aren dapat
menghambat aktivitas enzim xantin
oksidase?
4. bagaimana tipe penghambatan ekstrak etanol biji
aren terhadap aktivitas enzim xantin oksidase?
 Maksud Penelitian
Penelitian ini bermaksud untuk mengetahui
apakah xantin oksidase dapat diisolasi dari susu
sapi dan mengetahui daya inhibisi ekstrak biji
aren (Arenga pinnata) terhadap aktivitas enzim
xantin oksidase.
TUJUAN PENELITIAN

✢ mengisolasi enzim xantin oksidase

menggunakan sodium klorida
✢ menentukan karakteristik enzim xantin
oksidase dari susu sapi
✢ menentukan persen (%) inhibisi ekstrak
etanol biji aren dalam menghambat
aktivitas enzim xantin oksidase
✢ menentukan tipe penghambatan ekstrak etanol biji
aren terhadap aktivitas enzim xantin oksidase?
 “
Manfaat Penelitian

Memberikan informasi ilmiah kepada pembaca

mengenai daya hambat ekstrak biji aren (Arenga
pinnata) terhadap aktivitas enzim xantin oksidase
 BAHAN PENELITIAN
✘ buah aren ✘ DMSO (dimethylsulfoxide)
✘ susu sapi ✘ natrium klorida (p.a)
✘ akuades ✘ ammonium hidroksida
✘ etanol 95% ✘ asam sulfat
✘ substrat xantin ✘ natrium hidroksida
✘ dikalium hidrogen fosfat trihidrat ✘ lowry A
✘ kalium dihidrogen fosfat ✘ aluminium foil
✘ asam klorida pekat (pro analisis)
✘ tablet allopurinol
 ALAT PENELITIAN

✘ spektrofotometer UV 1800
✘ inkubator
✘ neraca analitik
✘ hot plate
✘ rotary vacuum evaporator
✘ mikro pipet
✘ Vortex
✘ akuades
✘ peralatan gelas yang umum digunakan dalam
laboratorium.
 WAKTU dan TEMPAT
PENGAMBILAN SAMPEL

Pengambilan sampel Pengambilan sampel dilakukan

dilakukan pada tanggal 20 pada tanggal 07 Juli 2019. Susu
Juni 2019. Buah aren sapi diperoleh dari wilayah
diperoleh dari desa perkampungan desa Cakke,
Arabika, dusun Lurayya, Kecamatan Angeraja Kabupaten
Kecamatan Sinjai Barat. Enrekang, Sulawesi Selatan.
 WAKTU dan TEMPAT
PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juli 2019

hingga bulan November 2019 di Laboratorium
Biokimia Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Hasanuddin.
1. Preparasi Biji Aren dan Ekstraksi biji Aren dengan Etanol 95%

Biji Aren
o dibersihkan dan dipotong-potong menjadi ukuran yang lebih kecil
o dihaluskan menggunakan blender
o disaring menggunakan corong buchner
Bubur bijioaren
. 50 g

· diekstraksi dengan etanol 95%, 150 mL.

· dishaker 250 rpm selama 6 jam
· didiamkan selama 18 jam
· dan dilakukan proses berulang hingga diperoleh filtrat yang bening
· dievaporasi menggunakan rotary evaporator pada suhu 55° C
Ekstrak
kental
2. Uji Fitokimia

Ekstrak Biji
Aren

Uji Flavonoid Uji Uji Alkaloid Uji

terpenoid dan Saponin
Steroid dan tanin
 3. Isolasi Enzim Xantin Oksidase dari Susu Sapi

Susu sapi 500 mL

dipanaskan hingga suhu 30 °C

ditambahakan NaCl 175.85 gram
disentrifugasi , 3000 rpm, 4 ⁰C, 30 menit

Filtrat (ekstrak
Endapan kasar XO)
5. Penentuan Panjang Gelombang

Standar Asam Urat

• diencerakan menjadi berbagai variasi konsentrasi

• diukur serapan standar asam urat pada panjang
gelombang 200 nm – 400 nm menggunakan
spektrofotometer UV
Data
4. Karakterisasi Enzim Xantin Oksidase

Enzim Xantin
Oksidase

Penentuan
Penentuan pH Penentuan Suhu Pengaruh Ion
Konsentrasi
Optimum Optimum Logam
Substrat
5. Uji Aktivitas Enzim Xantin Oksidase

Substrat Xantin Buffer fosfat Crude XO

2 mL, 0.10 mM 3.9 mL pH 6.5 0.1 mL

•diprainkubasi 10 menit, 35⁰C

•divortex atau dikocok

•diinkubasi 30 menit suhu 35⁰C
•ditambahkan HCl 0.1 N 1 mL
•diukur serapannya pada λmaks 232 nm

Data
6. Uji Inhibisi Enzim Xantin Oksidase

Substrat Xantin Buffer fosfat Ekstrak Biji Crude XO

2 mL, 0.15 mM 3.9 mL pH 6.5 Aren 0.1 mL

•diprainkubasi 10 menit, 35⁰C

•divortex atau dikocok

•diinkubasi 30 menit suhu 35⁰C
•ditambahkan HCl 0.1 N 1 mL
•diukur serapannya pada λmaks 232 nm

Data
6. Uji Kinektika Inhibisi Enzim Xantin Oksidase

Variasi [Substrat] Buffer fosfat Ekstrak Biji Crude XO

2 mL 3.9 mL pH 6.5 Aren 160 ppm 0.1 mL

•diprainkubasi 10 menit, 35⁰C

•divortex atau dikocok

•diinkubasi 30 menit suhu 35⁰C
•ditambahkan HCl 0.1 N 1 mL
•diukur serapannya pada λmaks 232 nm

Data
Hasil penelitian!
 Isolasi enzim dari susu sapi

Hasil sentrifugasi 500 mL susu sapi segar

menghasilkan 348 mL supernatan atau (ekstrak
kasar) enzim
 Penentuan panjang gelombang maksimum
Spektrum dari serapan tertinggi standar asam urat (0.04 mg/mL)
dipilih sebagai panjang gelombang maksimum yakni ditunjukkan
pada panjang gelombang 232 nm
Kurva standar asam urat menghasilkan persamaan linear yakni y = 0.4272x +
0.2226, dimana y adalah absorbansi sampel larutan uji (crude XO) pada kondisi
optimum dan x adalah konsentrasi asam urat yang terukur.

Kurva standar asam urat pada λmaks 232 nm

 Penentuan pH Optimum

Kurva hubungan pH terhadap aktivitas enzim XO pada suhu 25 ⁰C,

konsentrasi substrat 0.15 mM.
 
1000 (1)

Aktivitas enzim digunakan dalam satuan unit (mU/mL)

yaitu jumlah enzim yang mengkatalisis satu μmol
substrat menjadi asam urat per menit pada kondisi
tertentu
 Penentuan [Substrat] Optimum

Kurva Hubungan konsentrasi substrat xantin dengan aktivitas enzim

XO pada suhu 25 ⁰C dan pH 6.5
 Penentuan Suhu Optimum

Kurva hubungan suhu dengan aktivitas enzim XO pada pH 6.5

konsentrasi substrat 0.10 mM.
 Pengaruh Ion Logam

Diagram hubungan konsentrasi ion logam Ca2+, Cu2+ dan Cd2+

terhadap aktivitas enzim XO
  aktivitas   dengan   ion   logam
A ktivitas   relatif   ( % ) = x  100 (2)
aktivitas   kontrol   ( tanpa   ion   logam )
 Hasil Uji Fitokima Biji Aren
No Kandungan Kimia Ekstrak Etanol 95% Biji
Aren
1. Tanin -
Flavonoid
2. Pb(CH3COO)2 -
H2SO4 -
3. Saponin -
4. Steroid -
5. Terpenoid ++
Alkaloid -
6. Mayer -
Dragendorff
Pengaruh Konsentrasi terhadap Aktivitas Enzim XO
Aktivitas Enzim
Larutan Uji Konsentrasi (ppm)
(mU/mL)
Kontrol negatif - 16.84
10 11.82
20 11.77
Ekstrak Biji Aren 160
40 11.54
ppm
80 11.17
160 10.43
10 12.75
20 12.10
Kontrol positif
40 11.87
(Allopurinol)
80 10.94
160 8.99
Persen (%) Inhibisi Ekstrak Biji Aren terhadap
Aktivitas Enzim XO (mU/mL)
38.08
40.00
33.66
35.00 29.80 30.08 31.46
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
10 20 40 80 160
Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Aren (ppm)
   Aktivitas   Blanko −   Aktivitas   sampel   uji  
% inhibisi  =    x  100 %  (3)
Aktivitas   Blanko

Aktivitas blanko : aktivitas enzim tanpa penambahan

ekstrak uji
Aktivitas sampel uji : aktivitas enzim tanpa penambahan
ekstrak uji
 Grafik Hubungan Konsentrasi terhadap
Persen (%) Inhibisi(mU/mL)
%Inhibisi 40.00
35.00 f(x) = 0.06 x + 29.15
30.00 R² = 1
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Aren (ppm)

 Persen (%) Inhibisi terhadap
Aktivitas Enzim XO (mU/mL)

P e r se n (% ) In h ib isi
50.00 46.63
45.00
40.00 35.04
35.00 28.15 29.53
30.00 24.28
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
10 20 40 80 160
Konsentrasi Allopurinol (ppm)
Grafik Hubungan konsentrasi terhadap aktivtas enzim
(mU/mL)
% inhibisi
50.00
45.00
f(x) = 0.14 x + 23.95
40.00
R² = 0.99
35.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Konsentrasi Allopurinol (ppm)

Data IC50 Ekstrak Etanol Biji Aren dan Allopurinol

No Larutan Uji IC50 (ppm) Daya Hambat

1 Kontrol Positif 184 Lemah

(Allopurinol)

2 Ekstrak Etanol Biji Aren 372.4 Sedang

Grafik Linear Lineweaver-Burk Kinetika Inhibisi Enzim XO tanpa
inhibitor (♦) dan dengan Inhibitor (Ekstrak Etanol Biji Aren (■).

 1
−
Km

tanpa inhibitor
Perubahan Nilai Km dan Vmaks Enzim Xantin Oksidase terhadap
Ekstrak Etanol Biji Aren

Km Vmaks Tipe Inhibitor

tanpa inhibitor 33.78

(♦) 0.145 mM
mM/menit
dengan Non-
Inhibitor 24.27 kompetitif
(Ekstrak Etanol 0.135 mM
mM/menit
Biji Aren (■)
 kesimpulan
1. Enzim xantin oksidase dapat diisolasi dari susu sapi menghasilkan ekstrak
kasar enzim dengan aktivitas 16.84 mU/mL.

1. Karakteristik enzim xantin oksidase diperoleh pada pH 6.5, suhu

35 ⁰C, konsentrasi substrat 0.10 mM yang diukur pada λmaks
232 nm. Ion Ca2+ dan Cd2+ bertindak sebagai aktivator dan ion logam Cu2+
sebagai inhibitor

3. Ekstrak Etanol Biji Aren 160 ppm dengan daya hambat sebesar 38.08%
dengan Allopurinol sebagai kontrol positif dengan daya hambat 46.63%.

4. Hasil variasi konsentrasi substrat terhadap ekstrak etanol biji aren

menunjukkan nilai Km 0.0145 mM dan Vmaks 24.27 mM/menit.
Berdasarkan data tersebut tipe inhibisi ekstrak etanol biji aren termasuk
tipe inhibitor non-kompetitif.
 SARAN

Saran untuk penelitian selanjutnya yaitu melakukan isolasi enzim xantin

oksidase hingga tahap pemurnian lebih lanjut sehingga dapat diperoleh
aktivitas enzim yang lebih baik. Dan menggunakan sampel inhibitor dari
tanaman lainnya dengan menggunakan ragam pelarut organik yang lain,
agar diperoleh ekstrak yang dapat memberikan daya hambat yang lebih
tinggi.
 thanks!
You can find me at
@Fajriah1103
user@nurulfajriah1103@gmail.com
a. Uji Flavonoid

Ekstrak
etanol biji
aren 2 mL

• ditabung (I) ditambahkaan beberapa tetes Pb(CH3COO)2

• ditabung (II) ditambahkaan beberapa tetes (H2SO4).
• hasil positif ditunjukkan oleh adanya endapan kuning (I),
jingga, atau merah (II)
Perubahan
warna
b. Uji Triterpenoid dan Steroid

Ekstrak
etanol biji
aren 5 mL

• ditambahkan klroforom 2 mL tabung (I) ditambahkan

asam sulfat 3 mL secara perlahan
• Ditambahkan asam asetat anhidrat 2 mL, sebanyak 2 mL
asam sulfat secara perlahan pada tabung (II)

Perubahan
warna
 c. Uji Alkaloid

Ekstrak etanol
biji aren 3 mL

• ditambahkan 3 mL HCl 1% dan dipipet 1 mL ke dalam

3 tabung berbeda (masing-masing)
• ditambahkan secara berturut-turut pereaksi Dragendorf dan
Meyer
• uji positif menunjukkan adanya perubahan warna

Data
d. Uji Saponin dan Tanin

Ekstrak etanol
biji aren 2.5 mL

• dipipet ke dalam tabung pertama dan dicampur beberapa tetes akuades

kemudian dikocok selama 10 detik.
• terbentuk busa yang banyak menunjukkan adanya saponin
• dipipet ke dalam tabung reaksi kedua dan ditambahkan 2 mL akuades lalu
2 mL besi (III) klorida, jika terbentuk warna hitam positif menunjukkan
adanya tanin

Perubahan
warna
 •Penentuan pH optimum
Penentuan pH Optimum

Substrat Xantin Buffer fosfat Crude XO

2 mL, 0.15 mM 3.9 mL pH 6 0.1 mL

•diprainkubasi 10 menit, 25⁰C

•divortex atau dikocok

•diinkubasi 30 menit suhu 25⁰C
•ditambahkan HCl 0.1 N 1 mL
•diukur serapannya pada λmaks 232 nm

Data