1.

Terdapat 2 jenis elektroforesis yaitu dengan menggunakan gel agarosa dan gel
poliakriamid. Jelaskan perbedaan prinsip dari kedua metode tersebut dan
metode manakah yang lebih baik digunakan untuk mendeteksi berat molekul
protein!
2. Metode manakah yang digunakan untuk mendeteksi kemurnian protein?
3. Bagaimana teknik dan prinsip kristalisasi/ pengendapan protein dengan
ammonium sulfat (Lampirkan tabel) !
4. Bagaimana metode kristalografi memperlihatkan struktur protein ?

Jawab :

1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Pemberian aliran listrik dapat menyebabkan terjadi
perpindahan aliran elektron dan zat objek, kemudian akan bergerak dari
elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini
berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel
berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih
lambat berpindah. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik
dengan massa DNA. Migrasi DNA ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk
DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibanding yang berukuran besar.
a. Metode Elektroforesis gel agarosa
didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media
penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik dengan
media yang digunakan adalah gel agarosa. Elektroforesis gel
agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
berukuran lebih besar dari 100-20.000 pasang basa (pb) dan
dijalankan secara horizontal. Molekul DNA bermuatan negatif
sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks
gel elektroforesis menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Lokasi fragmen
DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat
diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna seperti
 etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada
DNA. Gel yang diberi etidium bromide (senyawa karsinogenik)
dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai
untai berwarna merah-jingga. Agarosa memiliki beberapa
kelebihan yaitu memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan
tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan
kilo basa, mudah didapat (merupakan polisakarida yang diekstrak
dari rumput laut), harganya relatif murah, tidak bersifat toksik,
serta memiliki pori yang kecil.

b. Metode Elektroforesis Gel Poliakrilamid

Elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel
Electrophoresis) terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida
dan bis-akrilamida digunakan untuk memisahkan protein dengan
ukuran 5-200 kDa, sedangkan untuk pemisahan fragmen DNA
hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu antara 5-500
bp. Gel poliakrilamid tidak padat melainkan mempunyai saluran
labirin pada bangunan serat/gel-nya. Selain itu, laju pemisahan gel
poliakrilamid terhadap fragmen DNA lebih lambat dibandingkan
menggunakan gel agarosa dan juga dibutuhkan presentase
konsentrasi yang lebih banyak serta voltase yang digunakan juga
lebih tinggi.
Elektroforesis yang lebih baik digunakan untuk mendeteksi berat molekul
protein adalah elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamid. pada
saat elektroforesi protein akan bergerak dari elektroda negative menuju
elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung
pada berat molekulnya. semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh
pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya semakin tinggi sebaliknya
protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih
pendek atau mobilitasnya rendah. Protein dengan mobilitas tinggi akan
berhenti bergerak pada bagian bawah gel sedangan protein dengan mobilitas
rendah akan berhenti bergerak pada bagian atas gel. Berat molekul ditentukan
 dengan mengukur mobilitas rate (Mr atau Rf) molekul protein dalam gel
poliakrilamid berdasarkan kurva standar berat molekul dari protein standar.
Protein dengan berat molekul tertentu mempunyai nilai Rf yang berbeda pula.

2. Secara umum elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi

dan memurnikan fragmen DNA/RNA maupun protein. Kemurnian protein
dinilai oleh gel poliakrilamid dengan metode yang digunakan elektroforesis
gel poliakrilamid (SDS-PAGE) dimana pemisahan atau elektroforesis
memisahkan biomolekul-biomolekul bermuatan berdasarkan laju migrasi
dalam medan listrik. teknik ini dilakukan untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode lain seperti spektrometri massa, PCR,
cloning, immune blotting yang merupakan metode karakterisasi lebih lanjut.

3. Pengendapan pada metode salting-out terjadi karena proses persaingan antara

garam dan protein untuk mengikat air. Grup ion pada permukaan protein
menarik banyak molekul air dan berikatan dengan sangat kuat. Contohnya
Amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan protein akan
menyebabkan tertariknya molekul air oleh ion garam. Hal tersebut
disebabkan ion garam memiliki densitas muatan yang lebih besar
dibandingkan protein. Kekuatan ionic garam pada konsentrasi tinggi semakin
kuat sehingga garam dapat lebih mengikat molekul air. Menurunnya jumlah
air yang terikat pada protein menyebabkan gaya tarik menarik antara molekul
protein lebih kuat bila dibandingkan dengan gaya tarik menarik anatara
molekul protein dan air (mempertinggi interaksi hidrofobik), sehingga protein
akan mengendap dari larutan atau berikatan dengan kolom hidrofobik.
Selama proses salting-out, konsentrasi garam harus tetap dijaga agar tidak
menurun dalam larutan sehingga tidak terjadi pengendapan yang bersamaan
antara protein yang ingin dimumikan dan protein yang tidak diinginkan.

4. Mekanisme pengendapan protein akibat berkurangnya molekul pelarut yang

dibutuhkan untuk melarutkan protein, karena meningkatnya konsentrasi
garam disebut dengan salting out. Pengendapan dengan garam yang
 dilakukan dengan penambahan garam ammonium sulfat, apabila terdapat
garam-garam anorganik pada konsentrasi tinggi pada larutan protein maka
kelarutan protein akan berkurang sehingga akan mengendap karena
kemampuan garam terhidrasi lebih besar daripada molekul protein.

5. Kristalografi Sinar-X merupakan teknik yang dapat menyatakan posisi tiga

dimensi atom dalam molekul protein dengan tepat terutama struktur dan
fungsi protein. Kristal protein dapat diperoleh dengan menambahkan
amonium sulfat atau garam lain ke dalam larutan pekat protein untuk
mengurangi kelarutannya. Misalnya mioglobin akan berkristalisasi dalam
larutan amonium sulfat 3 M.

Penggaraman yang lambat menghasilkan kristal yang beraturan. Tiga

komponen yang berperan dalam analisis kristalografi sinar-X adalah
sumber sinar-X, kristal protein dan detector. Berkas sinar dengan panjang
gelombang 1,54 A diperoleh dengan mengakselerasi elektron terhadap
tembaga. Seberkas sinar X diarahkan pada kristal protein. Sebagian sinar-
X akan langsung menembus kristal dan sisanya akan terpencar ke
berbagai arah. Berkas yang terpencar (atau mengalami difraksi) dapat
dideteksi dengan film sinar-X. Kehitaman warna film berbanding lurus
dengan intensitas sinar-X yang dipencar atau dengan detektor elektronik
status padat. Prinsip dasar kristalografi sinar-X:
1) Sinar-X dipencar oleh elektron. Amplitudo gelombang yang dipencar
oleh atom berbanding lurus dengan jumlah elektron. Atom karbon akan
memencar sinar-X enam kali lebih kuat dibandingkan atom hidrogen.
2) Gelombang yang terpencar bergabung kembali. Tiap atom dalam
molekul berperan pada difraksi gelombang sinar-X. Pada film atau
detektor gelombang yang dipencar akan saling memperkuat bila dalam
fase yang sama dan akan saling menghilangkan bila tidak dalam fase
yang sama.
3) Cara gelombang yang telah terpencar bergabung kembali tergantung
hanya pada susunan atom.
Kristal protein yang dimasukkan dalam kapiler dan diletakkan pada
posisi yang tepat terhadap berkas sinar-X dan film. Dengan gerak kristal yang
teliti akan dihasilkan fotografi sinar-X berupa susunan titik-titik yang teratur
yang disebut refleksi. Intensitas tiap titik pada fotografi sinar-X dapat diukur
dan merupakan data dasar bagi analisis kristalografi sinar-X. Analisis
resolusi sinar-X yang ditentukan oleh jumlah intensitas yang tersebar yang
digunakan pada sintesis Fourier. Hasil terakhir analisis sinar-X ditentukan
oleh derajat kesempurnaan kristal. Bagi protein, batas resolusi biasanya kira-
kira 2 oA.