PENETAPAN KADAR KAFEIN DALAM SAMPEL DENGAN HPLC

1. Tujuan
1) Mahasiswa dapat menentukan kadar kafein dalam sampel dengan metode
HPLC.
2) Mahasiswa mengetahui prinsip kerja dan mampu mengoperasikan alat HPLC.
2. Dasar Teori
2.1 Kafein
Kafein merupakan jenis alkaloid yang secara alamiah terdapat dalam biji kopi,
daun teh, daun mete, biji kola, biji coklat, dan beberapa minuman penyegar. Kafein
memiliki berat molekul 194.19 dengan rumus kimia C8H10N4 O2 dan pH 6.9 (larutan
kafein 1% dalam air). Secara ilmiah, efek langsung dari kafein terhadap kesehatan
sebetulnya tidak ada, tetapi yang ada adalah efek tak langsungnya seperti
menstimulasi pernafasan dan jantung, serta memberikan efek samping berupa rasa
gelisah (neuroses), tidak dapat tidur (insomnia), dan denyut jantung tak beraturan
(tachycardia).

Gambar 1. Rumus struktur kafein

2.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan setiap komponen
dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan migrasi setiap
komponen yang disebabkan karena perbedan sifat interaksi dari setiap komponen
pada fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase geraknya metode kromatografi
terbagi menjadi kromatografi cair dan kromatografi gas. Salah satu contoh dari
kromatografi cair adalah HPLC ( High Perfomance Liquid Chromatograpy ) atau
Kromatgrafi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Kalau ditinjau dari sistem peralatannya,
maka KCKT termasuk kromatografi kolom, karena fase diamnya diisikan atau ter
”packing” di dalam kolom. Ditinjau dari proses pemisahannya, KCKT dapat
digolongkan sebagai kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi tergantung pada
butiran-butiran adsorben yang ada di dalam kolom
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi didefinisikan sebagai kromatografi cair
yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada
penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang
dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi
sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative
singkat. Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat
ditingkatkan dengan mengooptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,
selektivitas, dan efisiensi.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis
senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil), penentuan molekul-molekul
netral, ionik, maupun zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan
senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak,
dan dalam skala proses industri. Selain itu, dapat pula menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein
dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil
samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi,
memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan senyawa dalam
suatu campuran, memisahkan campuran, kontrol kualitas, dan mengikuti jalannya
reaksi sintetis. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif .

2.2.1 Prinsip Kerja KCKT

 Prinsip kerja KCKT sebenarnya tidak berbeda dengan prinsip-prinsip
kromatografi yang lain, yaitu pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara
melewatkan sampel pada suatu kolom, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar
masing-masing komponen-komponen tersebut dengan suatu detektor. Kerja detektor
bermacam-macam, tetapi pada dasarnya membandingkan respon dari komponen
sampel dengan respon dari larutan standar

2.2.2 Instrumentasi KCKT

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok
yaitu: (1) wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak, (3) alat untuk
memasukkan sampel, (4) kolom, (5) detektor, (6) wadah penampung buangan fase
gerak, (7) tabung penghubung, dan (8) suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram blok untuk sistem KCKT ditunjukkan oleh gambar berikut :

Gambar 2. Diagram blok sistem KCKT secara umum (Sumber : Settle F.

Handbook of instrumantal Techniques for Analytical Chemistry.
Prentice Hall PTR. New Jersey. 1997)
1. Tandon (reservoir)
 Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau
lebih. Reservoir yang baik disertai degassing system yang berfungsi untuk
mengusir gas-gas terlarut dalam solvent (pelarut). Gas terlarut tersebut antara lain
oksigen. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert degan kelarutan yang
sangat kecil, misalnya Helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu
2. Pompa
Pompa diperlukan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan
kecepatan dan tekanan yang tetap.
3. Katup injektor
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya
dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
4. Kolom
Kolom merupakan jantung KCKT. Keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat
5. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen
kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak
berderau, rentang tanggapan linearnya lebar, dan menanggapi semua jenis
senyawa. Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair kecepatan
tinggi modern (KCKT) ialah detektor UV 254 nm. Detektor UV-VIS dengan
panjang gelombang yang berubah-ubah sekarang mejadi popular karena dapat
dipakai untuk mendeteksi senyawa dalam lingkup lebih luas (28). Dua jenis
detektor yang dikenal didalam HPLC adalah (28) :
a. Detektor universal
Yaitu detektor yang bisa langsung digabungkan ke dalam instrument HPLC
tanpa memerlukan tambahan sistem khusus. Contoh : detektor UV-Vis,
detektor indeks refraksi, detektor fluorescence dan detektor hantaran.

b. Detektor khusus
 Yaitu detektor yang memerlukan sistem khusus agar bisa digunakan sebagai
detektor dalam HPLC, contoh : FTIR (Fourier Transform Infrared
Spectroscopy), MS (Mass Spectrometer), dan sebagainya.
2.2.3 Fase Gerak
Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu
yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai pelarut dipakai dalam semua ragam KCKT,
tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang berlaku umum. Fase gerak haruslah :
a. Murni
b. Tidak beraksi dengan kemasan
c. Sesuai dengan detektor
d. Dapat melarutkan cuplikan
e. Mempunyai viskositas yang rendah
f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah jika diperlukan.
g. Harganya wajar
Secara umum, pelarut pengembang yang akan dipakai untuk keperluan KCKT
harus dari derajat untuk KCKT.

2.2.4 Waktu Retensi (tR)

Waktu retensi (tR) adalah selang waktu yang diperlukan oleh linarut (solut)
mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor
(27).

2.3 Interpretasi Data

Adapun analisis KCKT dapat digunakan untuk:
1. Analisis kualitatif yaitu menentukan komponen-komponen dalam cuplikan.
2. Analisis kuantitatif yaitu menentukan jumlah (%) dari komponen yang terpisah
dari suatu cuplikan.

Berikut penjabaran dari analisis KCKT secara rinci dengan:

1. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KCKT harus ada senyawa standar sebagai
pembanding. Senyawa yang belum diketahui dalam cuplikan yang dimungkinkan
senyawa A, dan kemudian kita menginjeksikan senyawa murni A sebagai referensi,
maka kita dapatkan 2 kemungkinan :
a. Data waktu retensi tidak sama, maka senyawa-senyawa tersebut tidak
sama.
b. Data waktu retensi sama, maka keduanya mungkin mirip atau sama, tetapi
dapat merupakan senyawa yang berbeda karena senyawa yang berbeda
kadang-kadang mempunyai waktu retensi yang sama.
Pada instrumen KCKT yang dirancang dengan baik, waktu retensi sangat
terulang. Simpangan baku waktu retensi sekitar 0,2-2% tergantung pada instrumen,
kolom dan pelarut. Makin besar derajat keterulangan waktu retensi, maka makin
besar kepastian kita dalam membeda-bedakan berbagai senyawa yang diidentifikasi.
Dengan membandingkan waktu retensi senyawa pembanding dengan waktu retensi
senyawa yang diidentifikasi, kita dapat mengidentifikasi puncak secara kualitatif.
Analisis kualitatif juga dapat digunakan metode spiking, yaitu dengan cara
menambahkan senyawa standar untuk mengetahui senyawa yang dianalisis. Sebagai
contoh : Cuplikan terdiri atas 4 komponen dan diasumsikan bahwa dalam cuplikan
mengandung senyawa standar misalnya senyawa X, kemudian diinjeksikan kembali
ke KCKT. Puncak A, B, C ketinggian dan waktu retensi sama dengan percobaan
sebelumnya, sedangkan puncak D bertambah tinggi dan waktu retensinya sama,
sehingga kemungkinan D=X, tetapi juga D ≠ X. Untuk membuktikan bahwa dua
senyawa dengan waktu retensi sama merupakan senyawa yang sama, dilakukan
dengan cara :
a. Melakukan analisis dua kali pada kolom yang berbeda.
b. Analisis yang lain pada dua suhu yang berbeda.
Untuk lebih menyakinkan bahwa kedua senyawa tersebut memang sama maka
dilakukan isolasi senyawa D, kemudian diuji dengan IR, NMR, dan MS.
2. Analisis Kuantitatif
Dasar analisis ini adalah pencatat memberikan sinyal atau kromatogram yang
sebanding denagan banyaknya komponen atau senyawa dalam cuplikan. Batasan-
batasan dalam analisis kuantitatif adalah :
a. Kisaran konsentrasi sangat terbatas, yaitu masih dalam kisaran linearitas detektor
(Pembandingan konsentrasi yang terbesar dengan terkecil dimana respon detektor
masih linear). Jika jumlah cuplikan besar dipaksakan, maka detektor tidak mampu
mendeteksi.
b. Respon detektor. Jenis detektor yang berbeda memberikan respon yang berbeda
terhadap komponen cuplikan. Perbedaan ini dalam hal waktu retensi dan
ketinggian puncak.
Pengukuran puncak dapat dilakukan dengan cara :
a. Pengukuran ketinggian puncak.
Cara ini merupakan cara yang paling mudah dan cepat, yaitu dengan cara
mengukur ketinggian dari puncak sampai garis dasar.
b. Luas Puncak
Cara ini menggunakan cara yang paling banyak digunakan. Baik digunakan
secara manual dengan tangan ataupun dengan mesin secara otomatis yang
dikenal dengan intregator.
1. Tinggi x lebar pada setengah tinggi
Puncak kromatogram mirip pada segitiga. Cara ini mendekatkan puncak
sebagai segitiga.
HW ½H
Luas puncak = H x W, dimana W = lebar ½ H
2. Penimbangan
Cara ini dilakukan dengan menggunting puncak-puncak pada
kromatogram, kemudian ditimbang, sehingga dapat dihitung persen
relatifnya.Kelemahan cara ini adalah merusak kromatogram.
3. Intregator
Intregator dapat menghitung secara otomatik luas permukaan dari puncak-
puncak dan sekaligus mencatat waktu retensinya.
4. Alat dan Bahan
4.1 Alat
1. Corong Pisah 500 ml
2. Erlenmeyer 250 ml
3. Beaker gelas 250 ml
4. Gelas ukur 100 ml
5. Labu alas bulat 250 ml
6. Hotplate
 7. Pipet volum10 ml ; 1 ml
8. HPLC SHIMADZU LC-20 SERIES USING LC-SOLUTION SOFTWARE

4.2 Bahan
1. Sampel Teh
2. Kalsium Karbonat
3. air
4. Kloroforom
5. Methanol
6. Standar kafein
7. Kertas Saring
5. Prosedur Kerja
a. Isolasi Kafein
1. Timbang 10 gr daun teh kering tambah 10 gr kalsium karbonat dan 100 ml
air
2. Masukkan campuran ke dalam labu alas bulat dan hubungkan dengan
kondesor refluks
3. Panaskan selama 20 menit (waktu dihitung setelah refluks 1)
4. Saring dalam keadaan panas melalui corong dengan kertas saring biasa.
Kertas saring diganti jika terjadi kebuntuan. Residu dicuci dengan 150 – 250
ml air panas
5. Dinginkan filtrate sampai suhu kamar
6. Masukkan filtrate kedalam corong pisah dan diekstraksi 2 kali dengan 25
ml/10 ml kloroform
7. Gabung lapisan kloroform dan uapkan melalui proses destilasi
8. Larutkan residu dengan 10 ml kloroform lalu uapkan dalam lemari asam
dengan penangas uap.
9. Residu ditambah aseton kemudian larutan dinginkan dan saring dengan
penyaringan vakum
10.Kristal yang diperoleh dikeringkan diudara dan timbang
b) Pemisahan kafein dari minuman
1. 50 ml sampel diekstraksi dengan 50 ml diklorometan
2. Kocok dan biarkan 15 menit
3. Pisahkan
4. Saring
5. Pipet 1 ml dan masukan ke gelas vial
6. Analisis dengan HPLC
c) Pembuatan Larutan Standard Kafein dan Penyiapan Sampel
1. Buat larutan kafein 1000 ppm kemudian encerkan menjadi 10 ppm, 25 ppm,
50 ppm, dan 100 ppm.
2. Larutkan kristal kafein hasil isolasi dengan metanol dan masukkan ke dalam
labu takar 25 ml
3. Impitkan larutan lalu saring untuk menghilangkan kotoran sampel.
4. Sampel siap diuji HPLC, jika terlalu pekat, sampel dipipet 2 ml dan
diencerkan ke dalam labu takar 10 ml

d) Prosedur Pengoperasian HPLC

1. Hubungkan kabel power ke sumber listrik. Hidupkan UPS.
2. Siapkan kebutuhan analisa (baku, sampel, fase gerak dan peralatan lain).
3. Hidupkan SPD-20A, LC-20AD dan CBM-20A
4. Masukan suction filter ke dalam botol fase gerak masing-masing yang akan
digunakan (purging jika perlu).
5. Hidupkan CPU, monitor dan printer. Tunggu hingga muncul menu utama
Windows.

6. Pada menu utama Windows, klik , akan muncul tampilan berikut:

7. Klik akan muncul tampilan berikut:

8. Klik OK akan terdengar bunyi yang menandakan koneksi antara HPLC
dengan software. Akan muncul menu utama Real Time Analysis sepert
berikut:

9. Klik File, Open Method File untuk membuka file metode analisa kafein.
10. Isi parameter (dalam kotak merah) Total Pump A Flow (laju alir) 1,0
ml/mnt, solvent B Cont = 70 % (metanol) (untuk parameter LC Stop Time
isi dengan 0.01)

11. Klik untuk mengirim parameter ke sistem HPLC.

12. Hidupkan instrumen dengan mengklik . Semua unit akan aktif.

13. Tunggu hingga baseline cukup stabil. Untuk mengenolkan baseline, klik

.
14. Untuk mengetahui tingkat kelinieran baseline, lakukan Baseline Check

dengan mengklik akan muncul tampilan berikut:

15. Tunggu hingga kolom Result menunjukan Pass.

16. Klik akan muncul tampilan berikut:

17. Isi parameter yang diinginkan (Sample Name , misalnya kafein 25 ppm.
Sample ID boleh tidak diisi. Methode File, di klik sebelah kanan yang
berwarna hijau, untuk mencari file methode analisa kafein. Data File, klik
sebelah kanan yang berwarna kuning untuk menentukan folder
penyimpanan).
18. Klik OK akan muncul tampilan berikut:
19. Lakukan injeksi baku dengan cara memutar tuas injektor Rheodyne ke
posisi LOAD, injeksikan ± 60 L larutan baku, putar tuas ke posisi
INJECT. Analisis akan segera berlangsung sesuai dengan waktu analisis
yang telah diset.
20. Ulangi langkah diatas (point 2 – 5) untuk injeksi baku berikutnya.
1. Setelah injeksi, katup injeksi diputar kembali kebawah
dan syringe segera dikeluarkan
2. Sampel yang telah diinjeksi akan mengalir bersama
solven menuju kolom
3. Hasil pemisahan akan dideteksi oleh detektor melalui
recorder
4. Gambar kromatogram akan segera muncul pada
komputer

21 Mencetak Laporan

Pada menu utama Real Time Analysis, klik .

Drag/tarik format report yang akan kita gunakan kesebelah kanan :
 Kemudian pilih data yang akan dicetak dengan mengklik tab Data pada

jendela Data Explorer-nya :

Klik data file-nya dan drag ke sebelah kanan. Untuk melihat tampilan klik
Preview dan klik Print untuk mencetak.

5. Perhitungan

6. Pustaka

1. Adnan Mohamad.1997. Teknik Kromatografi. Yogyakarta: Andi.

2. Day, R. A. dan A. L. Underwood. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif.
Diterjemahkan oleh R. Soendoro. Jakarta: Erlangga
3. Rohman Abdul.2009. Kromatografi untuk Analisis Obat.Yogyakarta. Graha
Ilmu
4. Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh A.
Saptorahardjo. Jakarta: UI-Press.
5. Sastrohamidjojo H.1985.Kromatografi. Yogyakarta.Liberty
6. Vogel’s. 1986. Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. 4thed. London:
William Clowes Limited.