MAKALAH PRAKTEK PERALATAN

LABORATORIUM II
Tentang High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)

Dosen Pembimbing :
Hj. Her Gumiwang Ariswati, ST, MT
Syevana Dita, SST

Oleh :
Fitri Nur Rohmawati (P27838113023)
M. Ismik Alfian (P27838113033)
Pochik Tri W. (P27838113034)
Risalia (P27838113037)
Samsul Anwar (P27838113038)
3C2

Politeknik Kesehatan Kemenkes Surabaya

Jurusan Teknik Elektromedik
2015

i
 DAFTAR ISI

Judul i
Daftar Isi ii

I. Pengertian HPLC 1
II. Fungsi HPLC 1
III. Bagian-Bagian dan Fungsinya 3
IV. Prinsip Kerja 8
V. Jenis-Jenis Kolom pada HPLC 9
VI. Pengoperasian HPLC 10
VII. Pemeliharaan HPLC 11
VIII. Pelarut Untuk Memperbaharui Kolom 12
IX. Karakteristik Detektor HPLC 12
X. Kelebihan & Kekurangan HPLC 13
XI. Perbedaan Antara HPLC & GC 13
XII. Pertanyaan dan Jawaban 14
XIII. Kesimpulan 16

Daftar Pustaka 17

ii
I. Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan
HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu
dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru
antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-
asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa
kiral.
High performance liquid chromatography (HPLC) adalah suatu alat teknologi
kimia modern yang digunakan untuk menentukan komponen dalam suatu sampel
dengan metode pememisahkan komponen berdasarkan interaksi antara fase gerak
dan fase diam (McMaster 2007). Pengertian lain dari HPLC yaitu Kromatografi cair
berperforma tinggi (high performance liquid chromatography) merupakan salah
satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya
terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan
zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk
memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai
afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan
detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram
memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Gambar 1.1 Alat HPLC

 Beberapa kegunaan dari HPLC :
HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-
SAX.
Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
Aplikasi dalam ilmiah
Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan
metode HPLC denaturing (DHPLC). Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA
untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa. Kecepatan analisis (sekitar 5
menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0
kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi
dalam bidang biologi molekuler. Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal
nukleotida polimorfisme (SNP). Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam DNA
yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu
populasi dan juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan
penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah
dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.
Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:
Analisis Diazepam dalam darah
Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini
berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus
kimiaC23H27N. Diazepam termasuk obat antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif.
Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi
akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji
diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi
 Gambar 2.1 Struktur Kimiawi Diazepam

III. Bagian-bagian dan Fungsinya

Berikut adalah bagian-bagian dari alat HPLC secara umum.

Gambar 3.1 Bagian-Bagian HPLC

Mekanisme kerja HPLC

Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari
berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan
diameter kolom, kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak
 8. Suatu komputer atau integrator atau perekam
1. Wadah fase gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan
fase gerak harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat
pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,
bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi
jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC
grade).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal
penting dalam pemilihan fase gerak.
Beberapa deret eluotropik KCKT :
Parameter kekuatan Parameter kekuatan UV cut off
Pelarut
pelarut (adsorbsi) pelarut (partisi) (nm)
n-heksana 0,01 0,1 195
Sikloheksana 0,04 -0,2 200
Tetraklorometan 0,18 1,6 265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet

1 cm, pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat
dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak
bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang
digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
 Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit.
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat. Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan
tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih
umum dibandingkan dengan tekanan konstan.
POMPA (Sistem Penyalur Fasa Gerak)
Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
Bebas pulsa
Perlu de gasser
Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradient
Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)
JENIS JENIS POMPA
Pompa bolak balik (reciprocating pump)
- Paling banyak digunakan
- Jumlah vol pelarut tidak terbatas
- Dapat digunakan untuk elusi gradient
- Menghasilkan aliran berpulsa
Pompa jenis penyuntik (syringe pump)
- Kapasitas ruang pelarut 250 500 mL
- Untuk kolom kolom kecil (micro bore columns)
- Menghasilkan aliran bebas pulsa
4. Injektor (penyuntikan sampel)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel
ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai
RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering
digunakan untuk autosampler pada KCKT.
 kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi
secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter
partikel 3,5 atau 10m
dengan kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi
operasional (35-215 bar
Fase gerak Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. Untuk
fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol
atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3
ml/menit
Kinerja Efisiensi meningkat dengan
bekurannya ukuran partikel
fase diam, akan tetapi umur
kolom dengan ukuran
partikel 3 m lebih pendek.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan
kolom konvensional, yakni :
1. Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 1 atau 2 mm
Porous, silika ukuran kecil, silika
yang dimodofikasi secara kimiawi
(bonded phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil benzen.Rata-
rata diameter partikel 3,5 atau
10m dengan kisaran sempit.
1000-5000 psi
(70-350 bar)
Hidrokarbon+pelarut terklorinasi
atau alkohol untuk fase normal.
Untuk fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol atau
asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir 10-100
l/menit.Modifikasi instrumen
Sistem penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10l/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Sangat efisiensi dan sensitif, akan
tetapi lambat,konsumsi fase gerak
hanya dari kolom konvensional.
 3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH).
Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase
terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-
O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan
selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak
dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah,
sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing
peak) pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh
adanya interaksi adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan
pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni
proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan
menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi
(kandungan logam <1ppm).
7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan
elektrokimia.
 4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8l atau lebih kecil,
sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 l atau lebih kecil lagi.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Metode Pemisahan Umum dalam HPLC

Tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat ;
- FasaNormal
Fasa gerak nonpolar
Fasa diam polar
- Fasa Terbalik
Fasa gerak polar
Fasa diam nonpolar

DETEKTOR HPLC
Tergantung pada jenis senyawa dalam eluat ;
- Spektrofotometer UV Visible
- Indeks bias
- Spektrofluorimeter ( zat berfluoresensi )
- Konduktivitas listrik ( zat ionik )
- Spektrometer infra merah
- Spektrometer massa ( LC MS )
- Spektrometer NMR ( LC NMR

IV. Prinsip Kerja

Prinsip dari HPLC adalah pemisahan suatu komponen dengan adanya
interaksi antara fase diam (cairan) yang bersifat polar dan fase gerak (eluen) yang
bersifat non polar. Proses pemisahan ini berdasarkan distribusi antara fase diam dan
fase gerak yang terjadi pada kolom utama. HPLC merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk kebutuhan industri, pendidikan, maupun analisis
bahan obat, baik dalam jumlah banyak atau dalam sediaan farmasetik.
Berikut ini adalah blok diagram dari HPLC.
 Gambar 4.1 Blok Diagram HPLC

Cara kerja dari blok diagram di atas adalah sebagai berikut ini :
Cairan aquabides & metanol dipompa hingga tercampur dan sampai ke kolom.
Bersamaan dengan itu, sampel yang sudah dimasukkan dalam injector sampel
diteruskan sampai ke kolom dicampur dengan aquabides & metanol.
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan
keluar atas dasar kepolaran yang berbeda. Senyawa-senyawa yang kurang
kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan
sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar
lebih lama.
Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram tersebut akan dapat
diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR
digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan informasi luas area atau tinggi
puncak untuk analisis kuantitatif.

V. Jenis-Jenis Kolom pada HPLC

Kolom pada HPLC menurut ukurannya (panjang & diameternya) dapat dibedakan
menjadi 3 yaitu konvensional, microbore, dan high speed. Untuk ukuran panjang,
diameter dan dp dari masing-masing jenis di atas dapat dilihat pada gambar ini.
VI. Pengoperasian HPLC
Pengoperasian pada alat HPLC harus mengikuti standar prosedur pengoperasian
dari masing-masing alat untuk menjaga agar alat dapat awet bertahan lama dengan
performa hasil pengukuran yang tetap baik. Berikut adalah standar prosedur
pengoperasian HPLC merk Agilent yang berada pada Laboratorium Terpadu
Poltekkes Kemenkes Surabaya.
PREPARASI SAMPEL
Sampel harus dalam bentuk larutan.
Untuk skala analisis sampel dalam L, konsentrasi sampel yang diinjeksikan
tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal
adalah sekitar 40 ppm.

PREPARASI FASA GERAK

Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade
HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.
Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan Millipore kemudian
diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan
udara terlarut.
Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan, untuk
menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.
Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang
digunakan.

CARA INJEKSI
Ambil alat injek (syringe).
Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya metanol)
Kemudian bilas syringe dengan sampel
Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi tersebut tidak
boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau gelembung udara.
Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar terpasang
loop 20 uL
Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas), injek
cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum syringe dari
injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress data
 Setelah di layar muncul kembali tampilan Ready (hijau), maka pekerjaan
selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali sampel lain
sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running cuci kolom ke dalam
file cuci.

PENYALAAN ALAT
1. Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung eluen
dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat gelembung, buka
penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung pompa dan sedot
secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat penyedot gelembung yang
tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa kembali seperti semula.
2. Pastikan jumlah cairan metanol & aquabides mencukupi
3. Hubungkan kabel power alat dengan tegangan listrik 220V
4. Tekan tombol ON pada CPU computer
5. Tekan tombol ON pada alat berurutan dari bawah ke atas karena yang bawah
membutuhkan daya yang lebih besar. Dari bawah (ON Detektor), lalu ke tengah
(ON Kolom), lalu ke atas (ON Pompa) lalu tunggu hingga indikator lampu
berwarna hijau.
6. Suntikkan sampel pada injektor sampel
7. Buka aplikasi pengukuran HPLC pada computer
8. Lakukan setting pemilihan cairan metanol dan aquabides, suhu pada computer
9. Lakukan pengukuran pada sampel
10. Setelah selesai digunakan, matikan komputer terlebih dahulu
11. Tekan tombol power pada alat ke posisi OFF mulai dari atas ke bawah
12. Cabut semua kabel dari tegangan listrik

VII.Pemeliharaan HPLC
Pemeliharaan alat HPLC sangat diperlukan untuk menjaga agar alat ini tidak
mudah rusak dan dapat menampilkan hasil pengukuran pada sampel secara tepat.
Berikut adalah prosedur pemeliharaan HPLC.
Jangan meletakkan alat di tempat yang terkena sinar matahari langsung
karena dapat membuat eluen menguap
Eluen (cairan pada fase gerak) harus pelarut murni/ mendekati murni dan
tidak kotor agar tidak merusak kolom
 - Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan,
kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan
mikroba.
- Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan
dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang
terbaik adalah pelarut Asetonitril.

VIII. Pelarut Untuk Memperbaharui Kolom

Kolom Silika Kolom Fase Kolom Fase Terikat Tak
Terikat Polar (Amino dan Polar Kolom Penukar Ion
Diol) RP-2, RP-8, RP-18
Heptana Air Air
Kloroform Methanol 0.1M Buffer
Etil Asetat Kloroform Air
Aseton Methanol 0.1M H2SO4
Etanol Air Air
Air 0.1M H2SO4 Aseton
0.1M Na2EDTA

IX. Karakteristik Detektor HPLC

Dasar Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Jenis
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri
Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

X. Kelebihan & Kekurangan HPLC

Kelebihan dari HPLC yaitu :
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya
memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat
yang tidak stabil.
kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
Kekurangan dari HPLC yaitu :
Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan
3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

XI. Perbedaan Antara HPLC & GC

Berikut ini adalah perbedaan dari HPLC dan GC

HPLC GC

Fasa diam Fasa diam berupa absorban yang tidak Fasa diam berupa suatu cairan
boleh larut dalam fasa gerak. bertitik didih tinggi dan proses
Ukuran yang lebih kecil (5 s/d 10 mm) serapannya lebih banyak berupa
dan tekanan sampai 6000 psi. Ukuran partisi yang berupa padatan dan
yang kecil dari fasa diam menyebabkan adsopsi memainkan peranan utama.
fasa diam mempunyai luas permukaan
yang besar, keseimbangan antar fasa
 Kolom Ada 2 tipe: Ada dua tipe utama kolom dalam
- Kolom analitik dengan performance kromatografi gas-cair. Tipe
tinggi, diameter dalam 1-6 mm pertama, tube panjang dan tipis
- Kolom preparative, diameter lebih berisi material padatan; Tipe kedua,
besar lebih tipis dan memiliki fase diam
yang berikatan dengan pada bagian
terdalam permukaannya.

Detektor Detektor yang paling banyak Detektor yang biasa digunakan

digunakan adalah detektor fotometer yaitu Detektor ionisasi nyala
sinar tampak atau sinar ultraviolet,
dan detektor indeks bias.

XII. Pertanyaan dan Jawaban

Saat kelompok kami melakukan presentasi, terdapat beberapa pertanyaan dari
teman-teman. Berikut ini adalah pertanyaan dan jawaban dari hasil diskusi saat
presentasi kami.
a. Penanya : Reza Herlindawati
Pertanyaan : Apakah efisiensi atau keuntungan dari penggunaan alat
HPLC?
Jawaban : Seperti yang telah dibahas di atas, keuntungan dari
penggunaan alat HPLC adalah
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan
daya memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang
tinggi.
 Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
Dilihat dari kelebihan-kelebihan di atas alat HPLC ini mempunyai kelebihan
terutama pada waktu analisa yang cukup singkat dibanding alat
chromatography jenis lain.
b. Penanya : Dinda Trisakti W.
Pertanyaan : Apakah parameter baik dan buruk dari alat HPLC?
Jawaban : Menurut kami, parameter keadaan baik suatu HPLC
salah satunya dapat dilihat pada fungsi masing-masing komponen yang jika
masih bekerja dengan baik maka akan menghasilkan grafik kromatogram
yang jelas yang ujungnya berbentuk agak lancip dengan waktu retensi yang
tidak melebihi normal.
c. Penanya : Skolastika Y. Juita
Pertanyaan : Pada kekurangan alat HPLC terdapat salah satu faktor
yaitu sering ada larutan standar yang tertinggal pada injektor. Apa yang
menyebabkan hal tersebut terjadi dan cara pencegahannya?
Jawaban : Jika ada larutan standar yang tertinggal pada injektor
dapat disebabkan larutan yang digunakan mungkin sudah kadaluarsa
sehingga tidak baik lagi, atau perawatan injektor yang kurang dibersihkan
setelah melakukan pengukuran. Maka solusi pencegahan masalah di atas
adalah pastikan larutan standar masih dalam keadaan baik, kemudian selalu
lakukan perawatan pada injektor dengan membilasnya setiap kali habis
pengukuran satu sampel dengan larutan pembersih standar misalnya
aquabides.
d. Penanya : Amne Gumilar C.M.
Pertanyaan : Dalam satu kolom yang digunakan apakah dapat untuk
mengukur banyak senyawa? Karena pada kromatogram terdapat grafik
dengan ketinggian yang berbeda.
Jawaban : Satu kolom dapat digunakan untuk mengukur beberapa
senyawa yang masih dalam keluarga yang sama misalnya keluarga glukosa
yang juga terdapat fruktosa, sukrosa, sakarosa dan lain-lain. Namun jika akan
melakukan pengukuran untuk jenis yang berbeda misalnya mengukur
kandungan suatu obat harus menggunakan kolom yang sesuai atau berbeda
dari kolom untuk pengukuran glukosa.
XIII. Kesimpulan
1. High performance liquid chromatography (HPLC) adalah suatu alat
teknologi kimia modern yang digunakan untuk menentukan komponen dalam
suatu sampel dengan metode pememisahkan komponen berdasarkan interaksi
antara fase gerak dan fase diam disertai dengan tekanan tinggi.
2. Prinsip dari HPLC adalah pemisahan suatu komponen dengan adanya
interaksi antara fase diam (cairan) yang bersifat polar dan fase gerak (eluen)
yang bersifat non polar. Proses pemisahan ini berdasarkan distribusi antara
fase diam dan fase gerak yang terjadi pada kolom utama.
3. Bagian-bagian dari HPLC adalah sebagai berikut :
a. Solvent : cairan untuk fase gerak
b. Control module : untuk mengontrol kinerja alat
c. Degasser : untuk menghilangkan gelembung pada sampel
d. Pump : pompa untuk menyedot cairan & sampel
e. Injector : tempat untuk menginjeksikan sampel
f. TCC : Thermostatted column compartment, control untuk suhu
cairan & sampel pada kolom
g. Detector : untuk mendeteksi kandungan zat-zat yang ada dalam sampel
 Daftar Pustaka

Hendri. 2012. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

DAN NERACA ANALITIK. http://hndries.blogspot.co.id/2012/10/laporan-
praktikum-haritanggal-kamis22.html (diakses tanggal 18 November 2015)

Malyati, Tatiek. 2012. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC),SENTRIFUGE, SENTRIFUGE KLINIS DAN NERACA ANALITIK.
http://blogtatiek.blogspot.co.id/2012/08/high-performance-liquid-
chromatography.html (diakses tanggal 18 November 2015)

Revan, Diyonarra. 2011. HPLC.

http://inspirasiuncak.blogspot.co.id/2011/05/hplc.html (diakses tanggal 18 November
2015)

Saisal, Nakhdiah. 2011. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).

http://nakhdiahsaisal.blogspot.co.id/2011/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-
hplc.html (diakses tanggal 18 November 2015)

---. 2009. High Performance Liquid Chromatography. http://pustaka.unpad.ac.id/wp-

content/uploads/2009/12/diktat_pelatihan_hplc_2007.pdf (diakses tanggal 18
November 2015)

---. 2011. High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

http://indonesiakimia.blogspot.co.id/2011/05/high-performance-liquid-
chromatography.html (diakses tanggal 18 November 2015)